徐　婧　張夢云　楊曉歐　李秀華

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年病科，河北　承德　067000)

慢性心力衰竭(CHF)是多種心血管疾病的終末階段，常伴有全身水鈉潴留、腎素-血管緊張素、醛固酮系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常和心肌重構(gòu)〔1〕，末期階段各種器官的衰竭現(xiàn)象也愈來愈嚴(yán)重，尤其腎功能不全，已經(jīng)成為CHF患者加重和死亡的獨(dú)立因子〔2〕。研究表明，CHF患者腎臟存在不同程度變性、壞死等病理改變，且隨病程進(jìn)展，病變也加重〔3〕。在CHF的早期，腎損害存在可逆性，即在腎損害的早期及時(shí)治療和控制，可能會(huì)得到完全恢復(fù)，因此，早期發(fā)現(xiàn)患者的腎損傷對(duì)CHF的治療和預(yù)后判斷有重要意義。雷米普利作為一種高效血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI),為臨床治療CHF的一線藥物〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，雷米普利具有非降壓依賴性腎臟保護(hù)作用，可減輕不同疾病動(dòng)物模型的腎損傷〔5〕，但具體機(jī)制不明。本研究主要觀察雷米普利對(duì)CHF大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及其因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3和細(xì)胞色素C的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑及藥品凋亡檢測試劑盒(美國羅氏公司)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，Trizol，細(xì)胞色素C引物(美國 Invitrogen公司)，caspase-3引物(上海生工公司)，caspase-3及細(xì)胞色素C兔抗多克隆抗體(武漢博士德公司)，雷米普利(昆山龍燈瑞迪制藥有限公司)，DEPC水(天津市福晨化學(xué)試劑廠提供)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2動(dòng)物來源及分組選擇健康雄性Wistar大鼠40只(北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號(hào)：2009-0004)，體重210～240 g，按清潔級(jí)動(dòng)物分籠飼養(yǎng),適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，余均經(jīng)腎上動(dòng)脈縮窄術(shù)建立CHF模型，將建模成功的20只大鼠隨機(jī)分為模型組和雷米普利組，每組10只，正常對(duì)照組只穿線不結(jié)扎，雷米普利組給予雷米普利 1 mg·kg-1·d-1灌胃，模型組及正常對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間3組大鼠均自由飲水,正常飲食。飼養(yǎng)室環(huán)境溫度保持18℃～28℃,相對(duì)濕度為40%～60%,定時(shí)用日光燈照射12 h/d。

1.3方法

1.3.1建立CHF模型在大鼠左腎動(dòng)脈下方0.5 cm處游離腹主動(dòng)脈，將去尖7號(hào)針頭與游離的腹主動(dòng)脈并行后，用粗絲線一起結(jié)扎阻斷血流，迅速抽出針頭見遠(yuǎn)端動(dòng)脈充盈后縫合腹腔。術(shù)后均給予連續(xù)3 d腹腔青霉素20萬U注射〔6〕，測血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí)造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為左心室舒張末壓(LVEDP)≥15 mmHg，正常對(duì)照組除未縮窄腹主動(dòng)脈外其余同模型組。

1.3.2標(biāo)本制取造模成功且給藥4 w后處死大鼠，立即取出腎臟,放入裝有冰鹽水的培養(yǎng)皿中沖洗后在冰塊上操作，剪取部分腎臟組織，置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，留做光鏡、原位末端標(biāo)記(TUNEL)熒光化學(xué)染色；取右腎皮質(zhì)組織于-80℃冰箱保存待行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western印跡實(shí)驗(yàn)〔7〕。

1.3.3蘇木素-伊紅(HE)染色將石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化后，置于蘇木素液中3～5 min，清水沖洗1 min，1%鹽酸分化3～5 s(切片變紅，顏色變淺即可)，0.5%氨水反藍(lán)，然后清水復(fù)洗10 min，放入伊紅液中1 min，再依次用95%和100%酒精脫水各10 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，制成HE染色切片。于光鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變。

1.3.4TUNEL測定腎臟細(xì)胞凋亡率取切片常規(guī)脫蠟至水，于室溫下浸泡于3 mol/L的過氧化氫甲醇液中30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗之后滴加復(fù)合酶，放入37℃溫箱中孵育20 min，滴加新配制的綠色熒光標(biāo)記液，標(biāo)本用蓋玻片覆蓋，于37℃溫箱中靜置1 h，繼續(xù)PBS清洗，加入轉(zhuǎn)化劑過氧化物(POD)，于37℃溫箱中孵育30 min，PBS洗后滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水透明封片。采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況并以此計(jì)數(shù)，細(xì)胞核被染為綠色熒光,即為陽性細(xì)胞，每個(gè)標(biāo)本觀察10張切片，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野(×200倍)中的凋亡陽性細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)，AI(%)=(凋亡陽性的細(xì)胞核數(shù)/總計(jì)數(shù)的細(xì)胞核數(shù))×100%，測定腎臟細(xì)胞的凋亡率。

1.3.5RT-PCR法檢測腎臟組織中caspase-3及細(xì)胞色素C mRNA的表達(dá)組織總RNA提?。河诘蜏乇渲腥〗M織50～100 mg，冰上解凍后加入1 ml Trizol勻漿搗碎，滴加氯仿(大約為Trizol的1/5)，充分離心后取上清，加入同體積異丙醇，用手上下混勻，沉淀RNA,取沉淀用75%乙醇洗滌，并將其溶于DEPC水中，紫外可見分光光度計(jì)儀器測量RNA濃度及純度。擴(kuò)增PCR中，需5倍PCR緩沖液，dNTP，Taq酶及特異性PCR引物；引物序列為:caspase-3,上游5′-TCCACGAGCAGAGTCAAA-3′，下游5′- TTCAACAAGCCAACCAAG-3′,擴(kuò)增片段208 bp；細(xì)胞色素C,上游5′-CCTTTGTGGTGTTGACCAGC-3′,下游5′-CCATGGAGGTTTGGTCCAGT-3′,擴(kuò)增片段140 bp；β-actin上游5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；下游5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，擴(kuò)增片段為452 bp；退火溫度依次為52℃、50.5℃、57℃。RT-PCR產(chǎn)物于溴已啶2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)下進(jìn)行分析，拍攝電泳圖像，目的基因caspase-3及細(xì)胞色素C mRNA的相對(duì)表達(dá)量由測定的目的基因與β-actin的RT-PCR產(chǎn)物電泳帶的灰度比值測得。

1.3.6Western印跡法檢測腎臟組織中caspase-3及細(xì)胞色素C蛋白含量取 50 μg上樣，5%聚丙烯酰胺

凝膠濃縮，12.5%分離膠電泳分離1.5 h，之后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，膜蛋白面向上置于5%脫脂牛奶中，4℃冰箱下封閉過夜，加適當(dāng)稀釋濃度的一抗，勻速搖床孵育2 h后漂洗3次，然后加入PBS稀釋的辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶500)，室溫反應(yīng)1 h后，TBST漂洗3次，化學(xué)發(fā)光底物顯色，曝光，成像。掃描膠片，檢測目標(biāo)條帶的光密度值，通過計(jì)算與內(nèi)參蛋白光密度比值確定目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及SNK檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1各組腎臟病理學(xué)觀察正常對(duì)照組大鼠腎臟無明顯病理改變;模型組大鼠腎小管系膜區(qū)增寬,細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)消失;雷米普利組大鼠腎臟出現(xiàn)類似模型組變化,但較模型組減輕，見圖1。

圖1　光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色大鼠腎臟形態(tài)學(xué)變化(HE，×200)

2.2各組腎臟細(xì)胞凋亡率比較凋亡細(xì)胞主要見于腎小管，正常對(duì)照組少見凋亡細(xì)胞，模型組可見較多凋亡細(xì)胞(P<0.01)，雷米普利組可見凋亡細(xì)胞，較正常對(duì)照組明顯增多(P<0.01)，但與模型組相比顯著減少(P<0.01)，見圖2，表1。

圖2　TUNEL法檢測各組腎組織細(xì)胞凋亡的變化(×200)

組別AI(%)mRNAcaspase?3細(xì)胞色素C蛋白caspase?3細(xì)胞色素C正常對(duì)照組284±089030±003030±003052±012037±013模型組4085±1231)079±0031)089±0011)271±0091)252±0121)雷米普利組1996±1191)2)059±0041)2)054±0061)2)177±0111)2)159±0111)2)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

2.3各組腎臟組織caspase-3及細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組相比，模型組caspase-3及細(xì)胞色素C mRNA均有較高表達(dá)(P<0.01)；與模型組相比，雷米普利組caspase-3及細(xì)胞色素C mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)，但仍明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，見圖3，表1。

1、4組為正常對(duì)照組；2、5組為模型組；3、6組為雷米普利組圖3　RT-PCR 法檢測各組腎組織 caspase-3及細(xì)胞色素C mRNA 表達(dá)

2.4各組腎臟組織caspase-3、細(xì)胞色素C蛋白比較caspase-3蛋白及細(xì)胞色素C蛋白主要表達(dá)于腎小管內(nèi)。與正常對(duì)照組相比，模型組、雷米普利組腎組織caspase-3及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)；但雷米普利組 caspase-3及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)較模型組顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖4，表1。

圖4　各組腎臟組織caspase-3及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)

3　討　論

細(xì)胞凋亡可能是腎臟病變的重要分子細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，凋亡不僅與神經(jīng)內(nèi)分泌因子和凋亡途徑有關(guān)，還與凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)〔8〕。在動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體通路是最普遍的凋亡機(jī)制和細(xì)胞凋亡核心，其功能及作用受到越來越多關(guān)注〔9，10〕。而這一途徑的激活又依賴線粒體膜電位的下降和線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)，觸發(fā)caspase的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，首先激活caspase-9，進(jìn)而caspase-9進(jìn)一步激活下游的caspase-3，6，7，誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔11〕。細(xì)胞色素C和caspase-3分別作為線粒體凋亡途徑的啟動(dòng)因子和關(guān)鍵執(zhí)行因子，在凋亡中有著不可替代的地位，也是檢測線粒體途徑致細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)〔12，13〕。

有實(shí)驗(yàn)顯示，血管緊張素Ⅱ是導(dǎo)致心臟、腎臟、肺臟及其他器官細(xì)胞凋亡的一個(gè)誘導(dǎo)劑〔14，15〕，其可能機(jī)制為血管緊張素Ⅱ與其受體結(jié)合后，通過Gqa調(diào)節(jié)蛋白激活磷脂酶C，加速細(xì)胞膜中的磷酸肌醇(Ip3)和甘油二酯(DAG)、Ip3刺激Ca2+從肌漿網(wǎng)釋放；DAG使蛋白激酶c同功異構(gòu)體ε從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜上L型Ca2+通道，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，從而引起胞質(zhì)線粒體內(nèi)Ca2+增多,影響線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開閉，破壞線粒體膜電位的穩(wěn)定性，同時(shí)激活Ca2+依賴的DNA酶系，使DNA斷裂，影響能量代謝，進(jìn)而影響線粒體結(jié)構(gòu)與功能，促發(fā)凋亡〔16，17〕。

雷米普利經(jīng)胃腸道吸收后在肝臟水解，生成具有活性的雷米普利拉，發(fā)揮競爭性抑制血管緊張素酶的作用〔4〕。由此推測可能由于雷米普利拉具有獨(dú)特的戊烷結(jié)構(gòu)，脂溶性高，故能與心、腎、血管組織中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的兩個(gè)活性位點(diǎn)同時(shí)結(jié)合，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，從而抑制了血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ的轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步阻斷了線粒體凋亡途徑，不但發(fā)揮了擴(kuò)血管、排鈉利尿和抑制交感神經(jīng)沖動(dòng)等作用，也起到了抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用。

本研究顯示，雷米普利具有抑制CHF大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能與減少血管緊張素Ⅱ的生成，改善線粒體結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞凋亡蛋白細(xì)胞色素C的釋放，下調(diào)caspase-3蛋白水平有關(guān)，并驗(yàn)證了雷米普利的腎臟保護(hù)作用，細(xì)胞凋亡作為腎臟病變的病理基礎(chǔ)，對(duì)雷米普利有一定的敏感性。

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