葛佳威　程正健　

(深圳市寶安第二人民醫(yī)院(集團(tuán))總醫(yī)院中醫(yī)科，廣東　深圳　518104)

1深圳市寶安第二人民醫(yī)院(集團(tuán))總醫(yī)院超聲科

順鉑及其他鉑類抗腫瘤藥是宮頸癌的一線化療用藥，但易發(fā)生腎毒性、神經(jīng)毒性、嚴(yán)重消化道反應(yīng)等不良反應(yīng)，限制順鉑的臨床應(yīng)用〔1，2〕。姜黃素是一種味微苦的結(jié)晶粉末，主要從天南星科和姜科植物的根莖中提取而來(lái)〔3〕。實(shí)驗(yàn)證明姜黃素具有抗腫瘤作用，具有抗癌廣譜、不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生阻斷作用，抑制調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞黏附分子表達(dá)及腫瘤血管生成〔4〕。本研究旨在探討不同劑量姜黃素對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及瘤組織中巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)水平的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物模型建立與實(shí)驗(yàn)處置

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌Caski細(xì)胞，購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，10×104U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caski細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，無(wú)血清RIMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，采用含25% Matrigel的無(wú)血清RIMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1.0×107/ml。

1.1.2模型建立35只SPF級(jí)BALB/c-nu雌性裸小鼠，鼠齡4～5 w，體重15～20 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。抽取Caski細(xì)胞混懸液200 μl(約2.0×106細(xì)胞)，將其接種于裸鼠的右側(cè)腋窩外側(cè)皮下。每天觀察接種部位有無(wú)出血和破潰，成瘤標(biāo)準(zhǔn)為移植瘤達(dá)到5 mm×5 mm。

1.1.3實(shí)驗(yàn)分組及處置35只小鼠成瘤成功后，按數(shù)字隨機(jī)法將動(dòng)物模型分為5組：陰性對(duì)照組、順鉑組(3 mg·kg-1·d-1)、姜黃素低劑量組(50 mg·kg-1·d-1)、中劑量組(100 mg·kg-1·d-1)和高劑量組(200 mg·kg-1·d-1)，每組各7只。陰性對(duì)照組給予羧甲基纖維素鈉灌胃15 d。順鉑組每隔3 d腹腔注射給藥，共5次。姜黃素組連續(xù)灌胃給藥15 d。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2裸鼠體重、移植瘤體積及瘤重的監(jiān)測(cè)停藥24 h后處死各組裸鼠，測(cè)量裸鼠體重，剝?nèi)×鲶w，測(cè)量移植瘤體積和瘤重，計(jì)算抑瘤率，將瘤體置于液氮中保存。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)(RT-PCR)取出液氮保存的移植瘤組織，采用Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)總RNA濃度及純度(OD260 nm/OD280 nm比值)，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩T-PCR引物序列(上海生工生物工程有限公司)。見表1。定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司) 檢測(cè)MIF和VEGF表達(dá)水平。qRT-PCR擴(kuò)增體系為10 μl，反應(yīng)條件：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示MIF和VEGF相對(duì)表達(dá)量。

表1　RT-PCR引物序列

1.4蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western印跡)取出液氮保存的移植瘤組織，加入RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA試劑盒(美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)組織總蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，加入羊抗大鼠單克隆抗體MIF(美國(guó)Santa公司)，羊抗大鼠單克隆抗體VEGF(美國(guó)Santa公司)，內(nèi)參-GAPDH抗體(美國(guó)Santa公司)，4℃孵育過(guò)夜。TBS-T洗膜后，加入HRP標(biāo)記的兔抗羊二抗(南京金斯瑞生物科技有限公司),室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司)觀察蛋白條帶，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度分析(ImageLab軟件)。

1.5免疫組織化學(xué)取出液氮保存的移植瘤組織，采用免疫組化SP法進(jìn)行檢測(cè)，所有樣本經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片；經(jīng)二甲苯脫蠟，在100%、95%、85%的酒精浸泡水化，98℃的枸櫞酸鈉溶液(0.01 mol/L，pH6.0)中浸泡15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清室溫封閉20 min，棄去血清，分別滴加MIF和VEGF一抗工作液(美國(guó)Abcam公司)，37℃孵育2 h，PBS洗滌3×5 min，滴加生物素二抗(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，室溫孵育30 min，PBS洗滌3×5 min，DAB顯色(武漢博士德生物工程有限公司)，充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。若細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒則認(rèn)為MIF或VEGF蛋白陽(yáng)性，隨機(jī)選取10個(gè)含有陽(yáng)性細(xì)胞的400倍視野進(jìn)行觀察。用 Image-ProPlus 計(jì)算MIF和VEGF蛋白累積光密度(IOD)。

2　結(jié)　果

2.1各組裸鼠體重、移植瘤體積及瘤重的變化藥物治療15 d后，與陰性對(duì)照組相比，順鉑組裸鼠體重顯著降低(P<0.05)，而姜黃素低、中、高劑量組與陰性對(duì)照組之間的裸鼠體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。順鉑組和姜黃素低、中、高劑量組的移植瘤體積均顯著小于陰性對(duì)照組(P<0.05)。姜黃素低劑量組移植瘤體積與順鉑組、姜黃素中、高劑量組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。順鉑組移植瘤瘤重明顯小于陰性對(duì)照組(P<0.05)，而姜黃素低、中、高劑量組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同劑量姜黃素組抑瘤率兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　各組裸鼠體重、移植瘤體積、瘤重的變化

與陰性對(duì)照組相比:1)P<0.05；與姜黃素低劑量組相比:2)P<0.05；與姜黃素中劑量組比較:3)P<0.05，下表同

2.2各組MIF、VEGF mRNA表達(dá)水平的變化順鉑組、姜黃素低、中、高劑量組MIF mRNA和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)；MIF mRNA相對(duì)表達(dá)量在姜黃素低、中、高劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；姜黃素低劑量組的VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量與姜黃素中、高劑量組及順鉑組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3各組MIF、VEGF蛋白表達(dá)水平的變化順鉑組、姜黃素低、中、高劑量組的移植瘤組織中MIF、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。MIF蛋白相對(duì)表達(dá)量在姜黃素低、中、高劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；姜黃素低劑量組的VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量與姜黃素中、高劑量組及順鉑組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表3　各組MIF、VEGF mRNA表達(dá)水平的變化

表4　各組MIF、VEGF蛋白的IOD值

3　討　論

中藥姜黃的干燥根莖，具有清心解郁、活血止痛、行氣破淤等功效，臨床上廣泛用于治療跌打腫痛、腹痛、胃炎等，姜黃素是其主要化學(xué)成分，一種天然的多酚類化合物，具有色澤穩(wěn)定、毒性極低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在食品添加劑和染料等領(lǐng)域〔5〕。此外，姜黃素還具有抗氧化、抗炎、預(yù)防血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗腫瘤等多種作用〔6～8〕。多項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，姜黃素在人類疾病的治療中具有很高的安全性和有效性〔9〕。Lev-Ari等〔10〕的動(dòng)物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理人非小細(xì)胞肺癌裸鼠移植瘤后，能夠顯著減緩移植瘤的生長(zhǎng)速度，并且延長(zhǎng)移植瘤小鼠的生存時(shí)間。Ferreira等〔11〕發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞移植瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)及移植瘤內(nèi)的血管生成。本研究結(jié)果提示姜黃素對(duì)宮頸癌移植瘤生長(zhǎng)有抑制作用，且姜黃素劑量越大抑瘤效果越強(qiáng)。并且在用藥期間，順鉑組小鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少，厭食，皮膚干澀，消瘦等表現(xiàn)。而其余各組沒(méi)有出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、消瘦、食欲降低、體表溫度下降等不良反應(yīng)，說(shuō)明姜黃素?zé)o毒副作用，具有較好的安全性。姜黃素參與并影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)與步驟，如姜黃素能夠降低胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中的淋巴管密度〔12〕、能夠增加肺癌細(xì)胞對(duì)化療敏感性〔13〕、對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用〔14〕。在惡性腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤微環(huán)境中的炎性細(xì)胞具有重要的作用，由腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)分泌的趨化因子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子促進(jìn)了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而刺激晚期癌癥細(xì)胞血管形成和侵襲〔15〕。MIF是一種能夠抑制離體巨噬細(xì)胞遷移的細(xì)胞因子，由活化T細(xì)胞分泌。Wang等〔16〕的研究證實(shí)，在宮頸癌細(xì)胞中，沉默MIF基因表達(dá)后，能夠抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。淋巴管生成是腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，VEGF是最早被證實(shí)的能夠促進(jìn)淋巴管生成的細(xì)胞因子。Sun等〔17〕的Meta分析結(jié)果顯示，VEGF陽(yáng)性表達(dá)增加了宮頸癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。Thacker等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)下調(diào)TGF-β信號(hào)通路活性，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果提示姜黃素能夠有效地降低瘤組織中MIF和VEGF表達(dá)，這可能是姜黃素抗宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制。

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