任冬花　關(guān)　巍　馮喜英　李西玲　趙　立

(西寧市第二人民醫(yī)院呼吸科,青?！∥鲗帯?10003)

1青海大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科

2中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一呼吸與重癥監(jiān)護(hù)內(nèi)科病房

哮喘以氣道高反應(yīng)性、可逆性氣流受限和慢性氣道炎癥為特點(diǎn)〔1〕循環(huán)纖維細(xì)胞隨著其來源、表型轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)和在組織損傷修復(fù)過程中的作用得到認(rèn)可，學(xué)者們對其研究越來越多〔2～4〕。本文探討循環(huán)纖維細(xì)胞在哮喘氣道重塑中的作用。

1　材料與方法

1.1材料SPF級(jí)健康雌性BALB/c 小鼠30 只，6 周齡，體重(20±3)g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證編號(hào)4200592945)。將其隨機(jī)編號(hào)并分為：對照組、哮喘組和氯化釓清空組，每組10只。室內(nèi)溫度18℃～25℃，濕度45%～55%，飼料和應(yīng)用水均經(jīng)充分消毒，保證充足食物和水分供應(yīng)。每日觀察小鼠生存狀態(tài)，及時(shí)更換敷料和鼠籠，保證其生存環(huán)境衛(wèi)生。卵原蛋白(OVA)、氯化釓、戊巴比妥鈉：美國Sigma 公司；氫氧化鋁：上海金賽醫(yī)藥化工有限公司；大鼠抗小鼠CD45 單克隆抗體：美國Biolegend 公司；免疫酶標(biāo)雙標(biāo)試劑盒購：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；多聚賴氨酸：金賽醫(yī)藥化工有限公司；兔抗小鼠Ⅰ型膠原單克隆抗體、兔抗小鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)單克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法第1、8、15天哮喘組和氯化釓清空組小鼠腹腔內(nèi)注射氫氧化鋁(2 mg)和OVA(20 μg)混懸液，對照組以等量磷酸鹽緩沖液(PBS)代替。第21天開始，哮喘組和氯化釓清空組給予50 mg/kg 戊巴比妥麻醉后，經(jīng)滴鼻吸入0.2%OVA激發(fā)小鼠，50 μl/只，每周3次，持續(xù)至第52天，共計(jì)13次，對照組等量PBS 等時(shí)間間隔滴鼻吸入。每次激發(fā)前10 min，氯化釓清空組經(jīng)尾靜脈給予氯化釓(2 mg/ml，10 mg/kg，每隔2 d 1次)，對照組和哮喘組用等量的PBS代替，給予時(shí)間和方式與氯化釓清空組相同。通過HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化及圖像分析；通過Masson染色觀察膠原沉積；通過免疫酶標(biāo)雙標(biāo)染色法觀察氣道纖維細(xì)胞表面表達(dá)。

1.3主要觀察指標(biāo)HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化及圖像分析 將肺組織標(biāo)本切片置于光學(xué)顯微鏡下，先于100倍下找到視野，后放大到400倍下仔細(xì)觀察各組小鼠支氣管肺組織的基底膜、平滑肌厚度變化及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞的改變情況。并在400倍下找到完整的支氣管橫斷面，用HIMAS-2000圖像分析軟件測量支氣管基底膜周徑(Pbm)、基底膜面積(Bm)和平滑肌面積(Wam)。Masson 染色觀察膠原沉積：光學(xué)顯微鏡下觀察并比較各組切片組織中膠原變化情況。參照文獻(xiàn)〔5〕，以固定顏色模式界定膠原，色調(diào)、飽和度、顏色強(qiáng)度等條件下測定氣道壁膠原面積(WAc)，結(jié)果以單位長度基底膜的膠原面積(WAc/Pbm，μm2/μm)表示。免疫酶標(biāo)雙標(biāo)染色法觀察氣道纖維細(xì)胞表面表達(dá)：將Ⅰ型膠原和α-SMA表達(dá)陽性的細(xì)胞質(zhì)經(jīng)即用型堿性磷酸酶染色液(BCIP/NBT)染色(陽性顯色為藍(lán)黑色)，CD45表達(dá)陽性的細(xì)胞質(zhì)經(jīng)AEC 染色(陽性染色為紅色)。染色后的組織切片置于光學(xué)顯微鏡下，先于低倍鏡下找到視野，放大到高倍鏡后，觀察比較CD45、α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)狀況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析、t檢驗(yàn)，兩個(gè)變量間的關(guān)系采用線性相關(guān)分析。

2　結(jié)　果

2.1各組小鼠一般情況表現(xiàn)哮喘組小鼠經(jīng)致敏和激發(fā)兩階段后，出現(xiàn)了不同程度的煩躁不安、易激惹、呼吸急促、喘息等癥狀；對照組小鼠行動(dòng)敏捷，未見異常；氯化釓清空組上述表現(xiàn)較哮喘組明顯減輕。

2.2各組支氣管肺組織病理改變及形態(tài)學(xué)觀察見圖1 和表1，哮喘組基底膜、平滑肌層厚度較對照組顯著增厚(P<0.05)，氯化釓清空組較哮喘組基底膜、平滑肌厚度顯著降低(P<0.05)。

圖1　各組肺組織病理學(xué)變化(HE，×400)

組別基底膜厚度平滑肌厚度對照組219±0391)617±0691)哮喘組890±0532305±074氯化釓清空組372±0321)886±0541)P值001001

與哮喘組比較：1)P<0.05

2.3各組氣道膠原沉積狀況見圖2，表2，各組Masson染色的結(jié)果顯示，對照組氣道和血管周圍少量的膠原沉積或不表達(dá)；哮喘組可見氣道和血管周圍大量的膠原沉積，其中以氣道的基底膜為主，肺泡間隔也可見膠原沉積，較對照組明顯增多；氯化釓清空組可見氣道和血管周圍有膠原沉積，肺泡間隔也可見膠原沉積均較對照組增多；但氯化釓清空組的膠原表達(dá)量均比哮喘組減少。HIMAS-2000 圖像分析結(jié)果顯示：與對照組〔(6.03±0.17)μm2/μm〕比較，哮喘組〔(31.74±2.08)μm2/μm〕和氯化釓清空組〔(16.02±0.92)μm2/μm〕的膠原表達(dá)量明顯增加(均P<0.05)；氯化釓清空組的膠原表達(dá)量較哮喘組減少，但仍多于對照組(均P<0.05)。

圖2　各組肺組織膠原沉積(Masson,×400)

2.4各組氣道CD45、α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)見圖3和圖4，與對照組氣道CD45、Ⅰ型膠原和α-SMA的表達(dá)相比，哮喘組和氯化釓清空組的表達(dá)明顯增加(P<0.01)；其中哮喘組比氯化釓清空組表達(dá)增加(均P<0.05)，見表2。

圖3　各組氣道CD45 和Ⅰ型膠原表達(dá)(免疫組化，×400)

圖4　各組氣道CD45和α-SMA表達(dá)(免疫組化，×400)

組別CD45+Ⅰ型膠原CD45+α?SMA對照組01372±0033501177±00171哮喘組02290±003221)02273±002361)氯化釓清空組01498±002131)2)01366±001501)2)

與對照組比較：1)P<0.01;與哮喘組比較：2)P<0.05

2.5小鼠氣道CD45、α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)水平與基底膜厚度的相關(guān)性哮喘組氣道組織CD45和Ⅰ型膠原表達(dá)與基底膜厚度呈正相關(guān)(r=0.86，P<0.01)；CD45和α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.95，P<0.01)。氯化釓清空組氣道組織CD45和Ⅰ型膠原表達(dá)與基底膜厚度呈相關(guān)(r=0.96，P<0.01)，氯化釓清空組氣道組織CD45和α-SMA表達(dá)與基底膜厚度呈正相關(guān)(r=0.89，P<0.01)。

3　討　論

氣道重塑的發(fā)生機(jī)制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者支氣管上皮下纖維細(xì)胞數(shù)量較正常人增多，并與支氣管基底膜的增厚相關(guān)〔6，7〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠氣道CD45高水平表達(dá)，表明氣道表達(dá)CD45 的細(xì)胞可能來源于循環(huán)纖維細(xì)胞。同樣，哮喘小鼠氣道Ⅰ型膠原的表達(dá)增高和氣道中膠原沉積量顯著增加，這一方面說明膠原的沉積在氣道重塑中起著至關(guān)重要的作用；另一方面表明纖維細(xì)胞具有相當(dāng)活躍的生成膠原的能力，提示慢性哮喘氣道重塑可能與氣道纖維細(xì)胞水平有關(guān)，與Nihlberg等〔8〕的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，相比正常受試者，輕度哮喘患者支氣管黏膜及肺泡灌洗液中共同表達(dá)CD45、Ⅰ型膠原和α-SMA 的纖維細(xì)胞數(shù)量增加，這些細(xì)胞多聚集在鄰近基底膜部位，且黏膜下纖維細(xì)胞的數(shù)量與基底膜的厚度呈正相關(guān)。

氯化釓是循環(huán)纖維細(xì)胞前體即單核細(xì)胞的特異性抑制劑，通過特異性誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞的凋亡來特異性抑制其分化〔9,10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明運(yùn)用氯化釓清空循環(huán)纖維細(xì)胞后，氣道重塑得到顯著抑制，提示循環(huán)纖維細(xì)胞在慢性哮喘氣道重塑中起著重要的作用〔11,12〕。

然而，本次實(shí)驗(yàn)并未提供直接的證據(jù)表明，哮喘小鼠支氣管黏膜中的纖維細(xì)胞是從循環(huán)中招募而來的纖維細(xì)胞，即氣道中的纖維細(xì)胞也有可能是來自于氣道中固有的未經(jīng)確認(rèn)的前體細(xì)胞。在分化過程中是否存在中間過渡的細(xì)胞亞型如前肌成纖維細(xì)胞；循環(huán)纖維細(xì)胞是直接分化為肌成纖維細(xì)胞，還是它刺激了組織中固有間質(zhì)細(xì)胞或者其他前體細(xì)胞的增殖分化，這些仍需進(jìn)一步研究。

1蘭蘭，高亞東，楊炯，等.循環(huán)纖維細(xì)胞與支氣管哮喘〔J〕.國際呼吸雜志，2014；34(5)：367-71.

2謝暉，王瑞蘭.循環(huán)纖維細(xì)胞與肺部疾病〔J〕.中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2013；12(1)：105-7.

3劉海燕.纖維細(xì)胞與支氣管哮喘呼吸道重構(gòu)〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2012；18(18)：2970-2.

4胥武劍，吳琳，李強(qiáng)，等.肌成纖維細(xì)胞在支氣管哮喘氣道結(jié)構(gòu)重塑中的作用〔J〕.中華哮喘雜志(電子版)，2011；5(1)：59-62.

5Palmans E，Kips JC，Pauwels RA.Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2000；161(2 Pt 1)：627-35.

6胥武劍，吳琳，李強(qiáng)，等.肌成纖維細(xì)胞在支氣管哮喘氣道結(jié)構(gòu)重塑中的作用〔J〕.國際呼吸雜志，2011；31(3)：210-3.

7劉圓圓，楊炯，李平，等.孟魯司特對循環(huán)纖維細(xì)胞參與哮喘小鼠氣道重塑的影響〔J〕.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014；35(4)：533-7.

8Nihlberg K，Larsen K,Hultgardnnilsso A,etal.Tissue fibrocytes in patients with mild asthma：a possible link to thickness of reticular basement membrane〔J〕? Respir Res，2006；7(1)：1-9.

9Schmidt M，Sun G,Stace MA,etal.Identification of circulating fibrocytes as precursors of bronchial myofibroblasts in asthma〔J〕.J Immunol，2003；171(1)：380-9.

10Willis BC，Liebler JM,Lubyphelps K,etal.Induction of epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1：potential role in idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Am J Pathol，2005；166(5)：1321-32.

11仇玉桃，魏紅娟，于紅霞，等.兒童重癥哮喘的診斷和治療〔J〕.中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2014；5(4)：43-4.

12黃雪瓊，檀衛(wèi)平，吳葆菁，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對重癥哮喘患兒外周血Th17/Treg 的免疫調(diào)節(jié)作用〔J〕.中國病理生理雜志，2014；30(9)：1694-7，1702.