林文科，吳吉芳，鄭志昂

(海南省第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南三亞　572000)

1　材料和方法

1.1研究對(duì)象選取2015年1月～2017年6月海南省第三人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的NSCLC患者128例，其中男性82例，女性46例，年齡43～76歲，平均年齡58.4±9.7歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)與2009年制定的最新版肺癌的診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理確診為NSCLC者；②術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療者；③未并發(fā)其他腫瘤者。臨床病理分期：I期16例，Ⅱ期50例，Ⅲ期34例，Ⅳ期28例；病理類型：鱗癌68例，腺癌51例，大細(xì)胞癌9例；病理分級(jí)：G1 28例，G2 47例，G3 53例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移77例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例。選擇同期良性病變(如肺結(jié)核、炎性假瘤和各種肺部良性腫瘤等)患者60例作為良性組，其中男性39例，女性21例，年齡45～77歲，平均年齡60.2±10.4歲；60例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性37例，女性23例，年齡40～75歲，平均年齡56.8±9.3歲。各組性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署患者知情同意書(shū)。

1.2主要試劑和儀器RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambio公司，在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)。C1000梯度PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD公司)和5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)。

1.3Real-Time PCR檢測(cè)空腹取靜脈血5 ml于EDTA抗凝管中，3 000 r/min，離心15 min后取上清，收集上清液于無(wú)RNA酶的2 ml離心管，所有標(biāo)本置于-80℃冰箱保存。按照總microRNA快速提取試劑盒(miRNeasy血漿提取試劑盒)說(shuō)明書(shū)從中提取總microRNA。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，microRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μl 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μl)，1.50 μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19 μl RNase抑制劑(20 U/μl)，4.16 μl無(wú)菌三蒸水。PCR總反應(yīng)體系為15 μl，反應(yīng)條件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，反應(yīng)體系為20 μl：1 μl引物及探針Mix(20×)，10 μl TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7．67 μl 無(wú)核酸酶的水。擴(kuò)增條件為：95℃10 min 1個(gè)循環(huán)，95℃15 s，60℃60 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的閾值的經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-141及miR-224的相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.4SCC-Ag檢測(cè)采用羅氏電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒，化學(xué)發(fā)光法測(cè)定SCC-Ag水平，操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2　結(jié)果

2.1各組血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表達(dá)水平比較見(jiàn)表1。NSCLC組血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表達(dá)水平均明顯高于良性組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而良性組與對(duì)照組血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1

各組血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表達(dá)水平比較

2.2NSCLC患者血清miR-141及miR-224表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表2。血清miR-141及miR-224表達(dá)水平與病理分期、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與年齡、性別、吸煙狀況、職業(yè)暴露、病理類型及腫瘤直徑無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2

NSCLC患者血清miR-141及miR-224表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3血清miR-141，miR-224及SCC-Ag對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值見(jiàn)圖1和表3。血清miR-141，miR-224，SCC-Ag及三項(xiàng)聯(lián)合診斷NSCLC的AUC(95%CI)分別為0.892(0.824～0.961)，0.864(0.793～0.932)，0.785(0.718～0.849)及0.913(0.847～0.981)，與對(duì)照組(AUC=0.5)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血清miR-141，miR-224及SCC-Ag診斷NSCLC的最佳截值分別為1.84，2.85，2.03 ng/ml。三項(xiàng)聯(lián)合診斷NSCLC的敏感度和特異度較好，分別為92.5%和82.7%。

表3

血清miR-141，miR-224及SCC-Ag對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值

圖1　血清miR-141，miR-224及SCC-Ag診斷NSCLC的ROC曲線

2.4NSCLC患者血清miR-141與miR-224，SCC-Ag的相關(guān)性見(jiàn)圖2。Pearson相關(guān)分析顯示，NSCLC患者血清miR-141與miR-224，SCC-Ag均呈正相關(guān)(r=0.782，=0.637，均P<0.01)；血清miR-224與SCC-Ag呈正相關(guān)(r=0.594，P<0.01)。

3討論microRNA是一類由19～22個(gè)成熟核苷酸組成的小分子非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，在晚期腫瘤患者血液中也檢測(cè)到異常microRNA的表達(dá)，有望成為治療腫瘤患者的重要靶點(diǎn)[7]。已有研究證實(shí)，microRNA可以穩(wěn)定存在于痰液、血清及組織中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)microRNA在惡性腫瘤中的表達(dá)譜與健康人存在明顯差異，這些特性使得microRNA有望成為新的腫瘤標(biāo)志物[8]。Li等[9]研究表明，microRNA的異常表達(dá)與NSCLC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，檢測(cè)肺癌組織或外周血microRNA的表達(dá)水平對(duì)NSCLC的早期診斷、臨床分期及預(yù)后評(píng)估具有重要的意義。Wang等[10]采用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)70例NSCLC患者和70例健康對(duì)照組血清miR-125a-5p，miR-145及miR-146a表達(dá)水平，結(jié)果提示miR-125a-5p，miR-145及miR-146a可能成為NSCLC臨床診斷的非侵入性的生物標(biāo)志物。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-141及miR-224在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且不同惡性腫瘤組織miR-141及miR-224的表達(dá)譜不同，miR-141及miR-224對(duì)腫瘤早期診斷、分期和預(yù)后評(píng)估等方面具有重要的提示作用[11，12]。

圖2　血清miR-141與miR-224，SCC-Ag的相關(guān)性

本研究顯示，NSCLC組血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表達(dá)水平均明顯高于良性組和對(duì)照組，提示血清miR-141及miR-224在NSCLC患者中異常表達(dá)，可能通過(guò)發(fā)揮癌基因的作用來(lái)調(diào)節(jié)NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在NSCLC患者臨床病理分期中，Ⅲ～Ⅳ期患者血清miR-141及miR-224的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期；miR-141及miR-224的表達(dá)隨著病理分級(jí)的增高而降低，高分化患者明顯低于低分化患者；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清miR-141及miR-224的表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。分析其原因可能是存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者腫瘤負(fù)荷往往較大，腫瘤組織可釋放更多的具有原癌基因作用的microRNA進(jìn)入血液，同時(shí)可抑制機(jī)體原有的具有抑癌作用的microRNA水平表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體microRNA表達(dá)水平異常升高。Mei等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-141通過(guò)調(diào)節(jié)pH結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白磷酸酶-1(PHLPP-1)和(PHLPP-2)表達(dá)在NSCLC的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用，并為NSCLC治療的潛在治療靶點(diǎn)。Wang等[14]采用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)56例NSCLC患者miR-224的表達(dá)情況，并分析其與NSCLC的臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-224通過(guò)調(diào)節(jié)RASSF-8表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖，可能是NSCLC的潛在治療靶點(diǎn)。因此，miR-141及miR-224在一定程度上參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，有望作為NSCLC的生物學(xué)標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

盡管國(guó)外已有報(bào)道m(xù)iR-141及miR-224可作為NSCLC的生物學(xué)標(biāo)志物，但二者聯(lián)合傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物診斷NSCLC的研究尚未發(fā)現(xiàn)。本研究中miR-141及miR-224聯(lián)合SCC-Ag診斷NSCLC有較高的診斷價(jià)值，其敏感度和特異度為92.5%和82.7%。在單項(xiàng)中miR-141診斷NSCLC的敏感度和特異度較好，為87.4%和84.5%，其最佳截值為1.84。Liu等[15]研究表明，血清miR-141可能成為NSCLC診斷的潛在的新型生物標(biāo)志物。張洪巖等[16]采用Real-Time PCR技術(shù)對(duì)31例NSCLC組織及癌旁正常肺組織的miR-224進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明miR-224有可能作為NSCLC的重要腫瘤標(biāo)志物。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，多種microRNA聯(lián)合診斷NSCLC的價(jià)值較高，其AUC高達(dá)0.970，這些microRNA在NSCLC篩查中具有廣闊的應(yīng)用前景。另有研究認(rèn)為，microRNA的高表達(dá)與NSCLC的生存率及致癌作用顯著相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)NSCLC預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[18]。相關(guān)分析顯示，NSCLC患者血清miR-141與miR-224呈正相關(guān)(r=0.782，P<0.01)，提示miR-141和miR-224聯(lián)合檢測(cè)有助于提高NSCLC診斷的準(zhǔn)確性。Wang等[19]研究也表明，5種血清microRNA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷NSCLC具有較高的價(jià)值，其AUC(95%CI)高達(dá)0.976(0.939～1.000，P<0.001)。雖然本研究中miR-141及miR-224對(duì)NSCLC的診斷效能優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物(SCC-Ag)，但若要應(yīng)用于臨床，仍需要擴(kuò)大樣本量，找到每個(gè)分類或者分型的標(biāo)志物將更有助于NSCLC的診斷。

綜上所述，血清miR-141及miR-224相比于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物有較高的特異度和敏感度，且與患者的臨床病理特征相關(guān)，有望作為診斷NSCLC的新型生物標(biāo)志物，與SCC-Ag聯(lián)合應(yīng)用可提高NSCLC診斷的準(zhǔn)確性。

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