高　飛，唐　晶，李景崗，張　鳳，龍　莉，曹得華，汪　鍵

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所，福州　350001； 2.武漢蘭丁醫(yī)學(xué)高科技有限公司，武漢　430206)

近年來(lái)，隨著數(shù)字化細(xì)胞圖像分析技術(shù)迅速發(fā)展，自動(dòng)化的掃描技術(shù)，結(jié)合現(xiàn)代神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析的方式，使細(xì)胞掃描過(guò)程簡(jiǎn)潔化、標(biāo)準(zhǔn)化，可高效篩選和分類異常細(xì)胞，為臨床醫(yī)生進(jìn)行疾病診斷提供幫助。目前國(guó)內(nèi)外已有一些全自動(dòng)血細(xì)胞圖像分析儀，例如瑞典Cella Vision公司推出的DM96全自動(dòng)血細(xì)胞數(shù)字圖像分析儀，該款儀器在白細(xì)胞分類、細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)檢測(cè)方面有一定臨床價(jià)值[1～3]，國(guó)內(nèi)的有北京賽爾蒂扶公司的CELLDIFF BCM-2血細(xì)胞形態(tài)分析儀，在白細(xì)胞分類方面也有文獻(xiàn)報(bào)道[4]。但目前臨床中應(yīng)用的血細(xì)胞圖像分析儀存在一些問(wèn)題，例如細(xì)胞圖像清晰度不高、軟件操作步驟較為繁瑣等問(wèn)題，影響細(xì)胞的分類診斷效率[5]。

LD BC-Ⅰ(Landing blood cell analyzer-Ⅰ型，武漢蘭丁高科技生物有限公司研制)全自動(dòng)血細(xì)胞圖像分析儀是一款采用CortexM3內(nèi)核32MCU為核心，通過(guò)以太網(wǎng)控制平臺(tái)3軸聯(lián)動(dòng)，CCD攝像頭取圖，計(jì)算機(jī)軟件對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與計(jì)算，最終實(shí)現(xiàn)有核細(xì)胞自動(dòng)分類及統(tǒng)計(jì)的分析系統(tǒng)。具有操作界面簡(jiǎn)潔、圖像分辨率高等特點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)主要從人工分析效率、分類結(jié)果相關(guān)性及各類細(xì)胞符合率等方面予以比較分析，考察該儀器臨床檢測(cè)性能。

1　材料和方法

1.1研究對(duì)象收集2016年10～12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院門診血細(xì)胞檢測(cè)分析病例共202例(EDTA-Na2抗凝)，其中男性105例，女性97例，年齡范圍15～77歲，中位年齡45歲。血細(xì)胞檢測(cè)由希森美康血液分析系統(tǒng)X2100測(cè)定，結(jié)果提示白細(xì)胞增高患者31例，減低28例，貧血患者13例，血小板減低患者7例，提示幼稚細(xì)胞5例，血細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果大致正常者118例。

1.2儀器和試劑LD BC-Ⅰ型血細(xì)胞圖像全自動(dòng)分析儀，主要由硬件和軟件兩部分組成。硬件部分包括生物學(xué)顯微鏡OLYMPUS BX41、高精度平臺(tái)、彩色攝像頭(IMAGINGSOURCE DFK 23G274)、計(jì)算機(jī)及計(jì)算機(jī)外設(shè)組成；軟件部分包括三維自動(dòng)定位調(diào)焦系統(tǒng)、圖像處理系統(tǒng)及診斷報(bào)告輸出系統(tǒng)。瑞氏-姬姆薩染液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1樣本準(zhǔn)備：同一例標(biāo)本平行制做血液涂片2張，室溫自然晾干，瑞氏-姬姆薩染色，流水沖洗，涂片自然晾干后先進(jìn)行人工鏡檢，然后再由儀器掃描檢測(cè)。

1.3.2人工鏡檢：血液涂片行瑞氏-姬姆薩染色后，由福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院2位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師(工作年限超過(guò)15年，中級(jí)或以上技術(shù)職稱)平行閱片，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)H20-2A[6]規(guī)定的方法步驟，分別對(duì)同一血涂片在顯微鏡下分類100個(gè)白細(xì)胞，共分類200個(gè)細(xì)胞，并記錄每一位醫(yī)生檢查所用時(shí)間，醫(yī)生所用時(shí)間是指：醫(yī)生在鏡下觀察分類有核細(xì)胞并記錄下各類細(xì)胞數(shù)量完成結(jié)果統(tǒng)計(jì)出具報(bào)告所用時(shí)間，最后對(duì)時(shí)間進(jìn)行平均計(jì)算。

1.3.3LD BC-Ⅰ型全自動(dòng)血細(xì)胞圖像分析儀測(cè)定：將醫(yī)生鏡檢后的血液推片置于該系統(tǒng)自動(dòng)平臺(tái)上，開(kāi)機(jī)，新建樣本編號(hào)后點(diǎn)擊開(kāi)始，分析儀就會(huì)自動(dòng)進(jìn)行掃描，掃描結(jié)束后自動(dòng)保存血細(xì)胞圖片信息，醫(yī)生可在電腦上進(jìn)行人工復(fù)核，將分類不正確的白細(xì)胞修改到所屬細(xì)胞類別。對(duì)有疑問(wèn)的細(xì)胞，通過(guò)軟件自動(dòng)定位功能，鎖定其所在坐標(biāo)軸，可在鏡下觀察。完成白細(xì)胞分類診斷后點(diǎn)擊生成報(bào)告，可編輯病人相關(guān)信息和診斷結(jié)論，發(fā)出報(bào)告。全自動(dòng)分析儀所用時(shí)間指：血液推片置于該系統(tǒng)自動(dòng)平臺(tái)該系統(tǒng)開(kāi)始至停止掃描、計(jì)算完成后，醫(yī)生觀察細(xì)胞圖像、修改所屬類別細(xì)胞并在鏡下復(fù)查可疑細(xì)胞，完成報(bào)告所需的時(shí)間。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2015(Microsoft office，Microsoft Inc.，Redmond，US)和MedCalc 15.0(Madcalc software，Mariakerke，Belgium)，血細(xì)胞圖像全自動(dòng)分析儀和人工鏡檢所用時(shí)間及細(xì)胞分類比較采用兩樣本的配對(duì)t檢驗(yàn)，兩種檢測(cè)方法相關(guān)性分析采用Passing-Bablok回歸分析，一致性分析采用Bland-Altman分析，相關(guān)性程度分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)(r)。

2　結(jié)果

2.1血細(xì)胞圖像自動(dòng)分析儀與人工鏡檢所用時(shí)間比較通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析202例血液樣本檢測(cè)時(shí)間，人工鏡檢平均所用時(shí)間為7.19±2.40 min，中位數(shù)為6.95 min；全自動(dòng)分析儀平均所用時(shí)間為3.38±1.12 min，中位數(shù)為3.20 min；血細(xì)胞圖像自動(dòng)分析儀所用平均時(shí)間較人工鏡檢縮短3.81±2.11 min，中位數(shù)為3.40 min，兩方法所用時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.626，P<0.01)。

2.2兩種方法的四種有核細(xì)胞分類計(jì)數(shù)均值比較同一標(biāo)本采用兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果屬于配對(duì)設(shè)計(jì)，各類白細(xì)胞兩種方法計(jì)數(shù)差值的均值見(jiàn)表1。配對(duì)t檢驗(yàn)顯示儀器法結(jié)果在中性粒、淋巴、單核和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)上與常規(guī)方法結(jié)果一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3不同方法檢測(cè)原始細(xì)胞及異常細(xì)胞識(shí)別能力比較分別對(duì)比人工鏡檢、儀器預(yù)分類、儀器預(yù)分類后人工復(fù)核細(xì)胞數(shù)的差異及符合率，結(jié)果見(jiàn)表2。人工鏡檢識(shí)別幼稚細(xì)胞和異常細(xì)胞數(shù)量均比儀器預(yù)分類少，有核紅細(xì)胞符合率最高，達(dá)到96.9%，其余5類細(xì)胞(原始/幼稚細(xì)胞、早、中、晚幼粒細(xì)胞、異型淋巴細(xì)胞)符合率均低于90%；比較儀器預(yù)分類后人工復(fù)核與單獨(dú)進(jìn)行儀器預(yù)分類的符合率，發(fā)現(xiàn)存在類似趨勢(shì)。

2.4人工鏡檢與血細(xì)胞圖像自動(dòng)分析儀結(jié)果方法學(xué)比較采用Passing-Bablok回歸法和Bland-Altman法分別對(duì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞四種有核細(xì)胞兩種檢測(cè)方法相關(guān)性及一致性分析，發(fā)現(xiàn)四種有核細(xì)胞進(jìn)行兩種方法比較的相關(guān)系數(shù)均大于0.7，符合率均大于90%，比較結(jié)果見(jiàn)表3。四種有核細(xì)胞進(jìn)行兩種方法的相關(guān)性分析見(jiàn)圖1，四種有核細(xì)胞進(jìn)行兩種方法的一致性分析見(jiàn)圖2。

表1

兩種檢查方法四種有核細(xì)胞分類計(jì)數(shù)均值比較

注：*刮號(hào)內(nèi)為中位數(shù)。

表2

不成熟有核細(xì)胞及異常細(xì)胞識(shí)別原始細(xì)胞及異常細(xì)胞能力比較(n)

表3

四種有核細(xì)胞兩種方法相關(guān)性和一致性分析表

3討論隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和信息化技術(shù)的不斷進(jìn)步，血細(xì)胞圖像分析技術(shù)獲得了飛速的發(fā)展。近十年來(lái)，全自動(dòng)血細(xì)胞圖像分析技術(shù)逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用，已經(jīng)能夠提供比較準(zhǔn)確的有核細(xì)胞分類結(jié)果。Cella Vision公司推出的DM96型全自動(dòng)血細(xì)胞數(shù)字圖像分析儀，能夠完成血涂片上載的自動(dòng)化、單細(xì)胞層定位、細(xì)胞識(shí)別、報(bào)告自動(dòng)生成等功能。在國(guó)外得到廣泛使用，在國(guó)內(nèi)，該分析儀僅在少數(shù)大型實(shí)驗(yàn)室使用，尚不普及。一方面由于該儀器價(jià)格較高，限制了在一般性臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用普及，另一方面該儀器在部分細(xì)胞類型檢測(cè)上尚不能滿足臨床需要，尤其是在血小板、紅細(xì)胞檢測(cè)等方面[7，8]。

LD BC-Ⅰ型血細(xì)胞圖像分析儀搭載高精度平臺(tái)和全自動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，可完成不同分辨率(10倍～100倍)的細(xì)胞自動(dòng)聚焦和定位功能，進(jìn)一步通過(guò)圖像采集和細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)能快速對(duì)部分有核細(xì)胞實(shí)現(xiàn)預(yù)分類。同時(shí)借助人工審核，修改細(xì)胞類型，并對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行及時(shí)更新。LD BC-Ⅰ分析儀具有圖像拼接功能，人工鏡檢后標(biāo)本的信息會(huì)丟失，而分析儀所采集的每個(gè)細(xì)胞形態(tài)都能完整的保留在系統(tǒng)中，通過(guò)點(diǎn)擊相應(yīng)的細(xì)胞就能精確找到其在涂片上面的具體位置，同時(shí)攝像頭捕捉的每張圖片能拼接成一張完整的血細(xì)胞圖譜，可方便檢驗(yàn)人員及時(shí)復(fù)審。本分析儀通過(guò)與云平臺(tái)有機(jī)結(jié)合，將掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行及時(shí)上傳，對(duì)診斷有疑問(wèn)的數(shù)據(jù)，自行識(shí)別，可進(jìn)行遠(yuǎn)程專家細(xì)胞會(huì)診，大大提高診斷的準(zhǔn)確性。借助網(wǎng)絡(luò)手段，能讓患者通過(guò)手機(jī)或電腦及時(shí)查詢自己的檢驗(yàn)報(bào)告，與DM96分析儀相比，本分析儀具有以下特點(diǎn)：體積更小巧，中文操作界面簡(jiǎn)潔方便，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的物鏡轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，圖像拼接系統(tǒng)等。

圖1　四種有核細(xì)胞儀器檢測(cè)與人工鏡檢相關(guān)性分析圖

圖2　四種有核細(xì)胞儀器檢測(cè)與人工鏡檢一致性分析圖

自動(dòng)分析儀對(duì)血液系統(tǒng)常見(jiàn)有核細(xì)胞準(zhǔn)確分類并顯著提高分析效率是進(jìn)入臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)，LD BC-Ⅰ分析儀分析所用平均時(shí)間較人工鏡檢效率明顯提高，兩種方法在中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)方面無(wú)明顯差異，說(shuō)明LD BC-Ⅰ分析儀能夠在常見(jiàn)有核細(xì)胞分析方面能較好地替代人工鏡檢。

本研究測(cè)試了分析儀對(duì)于不成熟有核細(xì)胞和異常細(xì)胞的識(shí)別能力，其中有核紅細(xì)胞、異型淋巴細(xì)胞、原始細(xì)胞和早幼粒細(xì)胞的符合率較高，原因可能是這四種細(xì)胞特征顯著，較易與其他類型細(xì)胞區(qū)別。中幼粒細(xì)胞和晚幼粒細(xì)胞符合率較低，可能的原因一方面是這兩種細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征重疊較多，易混淆；另一方面本系統(tǒng)中參考細(xì)胞庫(kù)數(shù)量較少，導(dǎo)致識(shí)別準(zhǔn)確率不高。經(jīng)人工復(fù)核后，以上六種有核細(xì)胞符合率均有不同程度的提高，但跟人工鏡檢分類仍有差異，會(huì)降低部分病理血象改變?nèi)缏粤＜?xì)胞白血病、類白血病反應(yīng)及核左移等的分析判斷，會(huì)影響或誤導(dǎo)臨床診斷，進(jìn)一步豐富參考細(xì)胞庫(kù)提高系統(tǒng)細(xì)胞分類識(shí)別能力，仍需要進(jìn)一步的改進(jìn)工作。

Cella Vision DM96是目前臨床應(yīng)用較多的血細(xì)胞分類分析系統(tǒng)，Stouten等[9]收集6 945例血涂片，比較Cella Vision DM96系統(tǒng)與人工鏡檢有核細(xì)胞分類相關(guān)性研究，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.997，0.995，0.933和0.978，相關(guān)性極高，同時(shí)兩種方法檢測(cè)結(jié)果有良好的符合率。LD BC-Ⅰ分析儀與人工鏡檢分類比較的相關(guān)系數(shù)略低，較Cella Vision DM96與人工鏡檢的分析比較數(shù)據(jù)略有差距，可能原因是本次測(cè)試搜集的樣本數(shù)量較少、細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)尚不夠豐富有關(guān)，但相關(guān)系數(shù)的變化規(guī)律與報(bào)道相似。另外Riedl等[10]比較四個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用DM96系統(tǒng)進(jìn)行外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)系數(shù)差異，發(fā)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中性粒細(xì)胞相關(guān)系數(shù)可變范圍在0.9～0.96之間、淋巴細(xì)胞相關(guān)系數(shù)可變范圍在0.83～0.94之間、單核細(xì)胞相關(guān)系數(shù)可變范圍在0.77～0.82之間、嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)系數(shù)可變范圍在0.70～0.78之間。本次試驗(yàn)的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)系數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道相似，單核細(xì)胞相關(guān)系數(shù)較DM96略低，可能由于中性桿狀核、晚幼粒細(xì)胞及單核細(xì)胞細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)尚不完善有關(guān)，有待進(jìn)一步提升優(yōu)化。

LD BC-Ⅰ型血細(xì)胞圖像分析儀通過(guò)自動(dòng)化圖像分析方法，分類原理類似于人工鏡檢，與人工鏡檢相比，明顯縮短細(xì)胞分類的時(shí)間，提高工作效率，對(duì)外周血中數(shù)量和比例高的有核細(xì)胞具有較高的辨識(shí)度，分類結(jié)果與人工相關(guān)性較好，一致性較高，具有臨床推廣應(yīng)用價(jià)值。不足之處在于，分析儀對(duì)于異常淋巴細(xì)胞、偏幼稚細(xì)胞及單核細(xì)胞的識(shí)別能力需進(jìn)一步提高，仍需進(jìn)一步豐富細(xì)胞庫(kù)，提高本系統(tǒng)早期及異常細(xì)胞的辨別能力及診斷效能。

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