吳　意，金　嫻，樊春卉，侯家興，趙　毅

(深圳市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳　518081)

呼吸道合胞病毒(RSV)是一種世界范圍內(nèi)廣泛流行，能引起嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染及威脅嬰幼兒生命健康的病原菌。同時(shí)也是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原體之一[1]。主要引起支氣管肺炎和急性支氣管肺炎[2]。RSV感染的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷指標(biāo)主要以抗原、抗體檢測(cè)為主，但多數(shù)以RNA的檢測(cè)作為臨床診斷依據(jù)。為了尋找RSV的特異性抗體，此次研究做了如下實(shí)驗(yàn)。

1　材料和方法

1.1研究對(duì)象從2015年10月～2017年5月因呼吸道感染在深圳市第七人民醫(yī)院兒科住院治療的兒童中篩選出咽拭子RSV-RNA陽(yáng)性50例患兒。年齡為10天～10歲，男性患兒23例，女性患兒27例。根據(jù)臨床疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)，按臨床癥狀、影像學(xué)和體征三者結(jié)合共確診四種疾病分別為急性喉氣管支氣管炎、支氣管肺炎、急性支氣管炎和急性上呼吸道感染。選取95例無(wú)呼吸道感染癥狀的兒童血清標(biāo)本作為對(duì)照組。男性48例，女性47例，年齡為58 min～10歲。

1.2儀器和試劑微量加樣器購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；漩渦振蕩混勻器購(gòu)于美國(guó)Vortex公司；C1301型迷你離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Labnet公司；BSC-1100A2X型生物安全柜購(gòu)于濟(jì)南鑫貝西公司；DW-FL253低溫冰箱購(gòu)于中科美菱低溫科技股份公司；Mastercyclerep realplex2熒光定量PCR儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；DK-8B型恒溫水育箱購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RT-6000酶標(biāo)儀購(gòu)于深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA試劑盒購(gòu)于德國(guó)維潤(rùn)賽潤(rùn)研發(fā)有限公司；RSV試劑盒購(gòu)于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.3方法

1.3.1樣本的收集：用鼻咽拭子取患者咽部分泌物，將標(biāo)本密封立即送檢，運(yùn)送采用0℃冰壺。標(biāo)本不能及時(shí)檢測(cè)可保存于-20℃，保存期為12個(gè)月。同時(shí)留取該患兒血清標(biāo)本和無(wú)呼吸道感染癥狀的對(duì)照組血清標(biāo)本。

1.3.2樣本RSV-RNA的提?。簢?yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3.3PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性標(biāo)本：RSV加10 μl RNA模板于RSV的PCR試劑盒反應(yīng)管內(nèi)，高速離心數(shù)秒后上機(jī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增循環(huán)條件為：首先40℃ 30 min，94℃ 3 min，然后93℃ 15 s，55℃ 45 s共10個(gè)循環(huán)，最后93℃ 15 s，55℃ 45 s共30個(gè)循環(huán)，采集熒光信號(hào)。結(jié)果分析及質(zhì)量控制：每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品和臨界(弱)陽(yáng)性質(zhì)控品作為質(zhì)量控制，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性。RSV陰性質(zhì)控品熒光信號(hào)無(wú)增長(zhǎng)，且無(wú)明顯S型擴(kuò)增曲線；RSV強(qiáng)陽(yáng)性和臨界陽(yáng)性質(zhì)控品熒光信號(hào)增幅明顯，呈典型S型擴(kuò)增曲線；且RSV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品CT值在9～12范圍，臨界陽(yáng)性質(zhì)控品CT值在17～20范圍，此三項(xiàng)要求必須在同次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新檢測(cè)。

1.3.4RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA檢測(cè)：RSV-IgM檢測(cè)先在800 μl稀釋液中加入10 μl標(biāo)本和200 μl RF吸附劑，搖勻后室溫放置15 min，使其充分反應(yīng)；RSV-IgG和RSV-IgA檢測(cè)先在1 000 μl稀釋液中加入10 μl標(biāo)本，充分混勻。取上述100 μl稀釋后的標(biāo)本，陽(yáng)性對(duì)照品(2孔)和陰性對(duì)照品(1孔)，分別加入相應(yīng)的抗體酶標(biāo)板孔內(nèi)，留空白對(duì)照1孔(不加任何液體)；將加樣后的酶標(biāo)板輕微震蕩，放置37℃水浴箱中孵育60 min；每孔注入稀釋后的洗滌液300 μl，靜置20～40 s后快速吸掉或倒掉洗滌液，共洗滌4次，將酶標(biāo)板放在吸水紙上拍干；除空白孔對(duì)照孔外，每孔加100 μl酶標(biāo)結(jié)合物；將酶標(biāo)板放置37℃孵育箱中，孵育30 min；再次洗板，操作步驟同上述洗板一致；每孔加100 μl底物溶液(含空白對(duì)照孔)，將酶標(biāo)板放置37℃孵育箱中，避光孵育30 min；每孔加100 μl終止液(含空白對(duì)照孔)，終止顯色反應(yīng)；在加終止液后的1 h內(nèi)進(jìn)行判讀結(jié)果(A值)，該測(cè)試為雙波長(zhǎng)(測(cè)定波長(zhǎng)為405 nm，參考波長(zhǎng)為620～690 nm范圍內(nèi)的任一波長(zhǎng))。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用卡方檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。

2　結(jié)果

2.1RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA在不同組別中的陽(yáng)性率分布情況實(shí)驗(yàn)組IgM，IgG，IgA及三者同時(shí)出現(xiàn)的陽(yáng)性率分別是24.00%(12/50)，60.00%(30/50)，22.00%(11/50)和16.00%(8/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.19，P<0.01)；對(duì)照組IgM，IgG，IgA及三者同時(shí)出現(xiàn)的陽(yáng)性率分別是8.42%(8/95)，94.74%(90/95)，14.74%(14/95)和0.00%(0/95)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=264.54，P<0.05)。IgM和IgG在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.69，27.70，均P<0.05)；IgA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.21，P>0.05)。

2.2RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA在不同性別及組別中的陽(yáng)性率分布情況見(jiàn)表1。不同性別在同一實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M中各抗體陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.10，P>0.05)；同性別在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間各抗體陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.16，P<0.01)。

表1

RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA在不同性別

2.3不同疾病組中RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA的檢出率情況在急性喉氣管支氣管炎中均未檢測(cè)到RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA；在急性上呼吸道感染中僅檢測(cè)到1例IgG陽(yáng)性；在支氣管肺炎及急性支氣管炎中特異性抗體IgM，IgG，IgA，IgM+IgG，IgG+IgA和IgM+IgG+IgA六種不同組合模式的檢出率分別為3.45%(1/29)，41.38%(12/29)，0%(0/29)，3.45%(1/29)，3.45%(1/29)，17.24%(5/29)和5.88%(1/17)，23.53%(4/17)，0%(0/17)，5.88%(1/17)，11.76%(2/17)，17.65%(3/17)。IgM，IgG和IgA在支氣管肺炎中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.06，P<0.05)，在急性支氣管炎中差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.42，P<0.05)。

2.4RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA在不同年齡組及產(chǎn)生的時(shí)間段分布情況見(jiàn)表2。不同年齡段在7天內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體IgM，IgG和IgA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.63，P<0.05)；四個(gè)年齡段患兒在21天內(nèi)產(chǎn)生RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA僅出現(xiàn)在1～5歲年齡段，檢出率分別為20.00%(2/10)，30.00%(3/10)和20.00%(2/10)。不同年齡段在21天內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體IgM，IgG和IgA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.33，P<0.05)。

表2不同年齡段在7天內(nèi)產(chǎn)生RSV特異性抗體的檢出率分布情況[n(%)]

不同年齡段nIgMIgGIgA<6個(gè)月6～12個(gè)月1～5歲5～10歲19181030(0)6(33.33)5(50.00)1(33.33)13(68.42)6(33.33)7(70.00)3(100)0(0)5(27.78)4(40.00)2(66.67)

3討論呼吸道合胞病毒(RSV)是一種有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科，肺炎病毒屬，有圓形和絲狀兩種形態(tài)。每年全球范圍內(nèi)RSV感染引起的嬰幼兒急性下呼吸道感染(ALRTI)病例約為3 380萬(wàn)，感染造成死亡病例約為6.6～19.9萬(wàn)，其中發(fā)展中國(guó)家占99%[3]。我國(guó)5歲以下嬰幼兒RSV感染病例占急性呼吸道感染住院病例的25%以上，約有40%～50%毛細(xì)支氣管炎及24%肺炎是RSV感染所致[4]。

此次實(shí)驗(yàn)研究選取的是RSV-RNA陽(yáng)性且出現(xiàn)臨床呼吸道癥狀的患兒，而血清中IgM的陽(yáng)性率僅為24%，說(shuō)明此指標(biāo)檢出率與臨床診斷符合率相距甚遠(yuǎn)，不宜作為早期診斷的特異性指標(biāo)，且與靳慶娥等[5]報(bào)道的0.63%和解娟等[6]報(bào)道的1.36%存在較大差異，這可能與研究對(duì)象人群不同和地域不同有關(guān)。對(duì)照組中IgM存在8.42%的陽(yáng)性率，說(shuō)明無(wú)呼吸道感染癥狀的人群中存在一定的RSV隱性感染，這可能是由于其自身免疫力強(qiáng)、感染的病毒量少或其基因型致病力弱的原因，并未引起明顯的臨床癥狀，同時(shí)也說(shuō)明IgM陽(yáng)性且無(wú)任何呼吸道感染癥狀時(shí)，并不一定需要進(jìn)行抗病毒治療。對(duì)照組中IgG存在極高的陽(yáng)性率，說(shuō)明大多數(shù)兒童都是RSV的易感人群，這與靳慶娥等[5]研究成人人群感染率低的結(jié)果是相符合的，而且有研究證明半數(shù)以上兒童可多次反復(fù)感染[7]。雖然人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到適應(yīng)性免疫應(yīng)答在抗RSV感染中的重要性，但是固有免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的早期反應(yīng)也有可能決定感染的結(jié)果，所以，兩者的作用都不可忽視。目前對(duì)兒童肺部固有免疫力的產(chǎn)生、成熟及其影響因素知之甚少，肺的固有免疫系統(tǒng)可能與全身免疫系統(tǒng)不同，其免疫機(jī)制也可能不相同。嬰幼兒呼吸道上皮細(xì)胞及其對(duì)病毒感染的反應(yīng)是不同于成人的，廣泛的上皮細(xì)胞脫落與嚴(yán)重的RSV疾病相關(guān)；呼吸道上皮細(xì)胞被認(rèn)為是早期細(xì)胞因子的重要來(lái)源，細(xì)胞因子的產(chǎn)生、黏液的分泌及上皮細(xì)胞凋亡的程度均與感染病毒株相關(guān)[8]。實(shí)驗(yàn)組IgM和IgA陽(yáng)性檢出率偏低，IgG受母嬰垂直傳播和繼往感染的影響，容易造成漏診和誤診，因此三者均不適合單獨(dú)作為早期輔助診斷RSV感染的特異性指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同性別在同一實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M中各抗體陽(yáng)性率無(wú)明顯差異性，說(shuō)明特異性抗體產(chǎn)生不受性別因素影響；而同性別在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間各抗體陽(yáng)性率有明顯差異性，說(shuō)明此次實(shí)驗(yàn)選取的對(duì)象符合臨床研究要求。研究中發(fā)現(xiàn)RSV感染主要引起兒童支氣管肺炎，其次是急性支氣管炎，支氣管肺炎及急性支氣管炎中以IgG的檢出率最高，且均未單獨(dú)檢測(cè)到IgA。在急性喉氣管支氣管炎中均未檢測(cè)到RSV特異性抗體IgM，IgG和IgA，僅在急性上呼吸道感染中檢測(cè)到1例IgG陽(yáng)性，這說(shuō)明RSV感染上呼吸道較難產(chǎn)生各種抗體，而感染下呼吸道產(chǎn)生IgM和IgA的陽(yáng)性率較一致。

研究發(fā)現(xiàn)在<6個(gè)月這個(gè)年齡段，患兒三周內(nèi)都未產(chǎn)生IgM和IgA，而檢出的IgG可能是母嬰垂直傳播的且對(duì)機(jī)體無(wú)保護(hù)作用，這說(shuō)明年齡越小，患兒產(chǎn)生特異性抗體IgM和IgA的速度越慢，其原因可能是由于患兒機(jī)體免疫系統(tǒng)不夠完善，不能及時(shí)有效地激活免疫應(yīng)答所致。隨著年齡的增長(zhǎng)，一周內(nèi)產(chǎn)生IgM和IgA的陽(yáng)性率隨之增長(zhǎng)，雖然在5～10歲年齡段有所下降，這可能與所選擇的研究對(duì)象人數(shù)局限性有關(guān)。在1～5歲年齡段，隨著感染時(shí)間的增長(zhǎng)，IgM，IgG和IgA平均每周提高10%左右的陽(yáng)性率。這說(shuō)明患兒產(chǎn)生特異性抗體與年齡和感染時(shí)間有一定相關(guān)性，年齡越大，感染時(shí)間越久，產(chǎn)生IgM，IgG和IgA的能力也隨之增強(qiáng)，并且其抗體產(chǎn)生時(shí)間因個(gè)體自身免疫力存在一定差異。在5～10歲年齡段，IgA檢出率最高，說(shuō)明分泌型抗體在機(jī)體免疫系統(tǒng)越成熟時(shí)越容易產(chǎn)生。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，IgA在RSV感染出現(xiàn)臨床癥狀的第二天就產(chǎn)生，比IgM提前一天出現(xiàn)，是產(chǎn)生最早的抗體，而且不單獨(dú)出現(xiàn)。有研究表明，兒童可以再感染相同的RSV株，但是第二次RSV感染的程度較低，表明自然感染可以產(chǎn)生部分保護(hù)性[9]，但不能阻止RSV再感染。

因此，以其血清學(xué)特異性抗體IgM，IgG和IgA作為RSV早期感染輔助診斷指標(biāo)，存在諸多影響因素。兒童RSV感染臨床診斷應(yīng)該以RNA檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)和體征三要素。預(yù)防RSV暴發(fā)流行及院內(nèi)感染，關(guān)鍵是在高發(fā)流行季節(jié)做好嬰幼兒和學(xué)齡兒童的防護(hù)措施，及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及時(shí)隔離、及時(shí)治療、防止蔓延。

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