蘆　嘉

(常州市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇常州　213003)

近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)作為一項準確、快速、經(jīng)濟的鑒定技術(shù)在臨床微生物檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用，目前的研究熱點是臨床樣本中病原菌的直接檢測，但MALDI-TOF MS的鑒定對象必須是細菌的單個菌落[1]，于是如何從樣本中獲得足量的細菌純培養(yǎng)就是MALDI-TOF MS普及過程中必須解決的問題。而胸腹腔積液的致病菌檢測一直是臨床的一項巨大需求，由于胸腹腔積液成分復雜，常規(guī)的細菌檢測加上藥敏試驗一般最快也需要2天以上的時間[2]，臨床對于縮短檢測時間的呼聲從未減少過。本研究對常見胸腹腔積液進行短期培養(yǎng)，增菌、離心、洗滌、富集細菌后用MALDI-TOF MS檢測，旨在建立胸腹腔積液細菌的快速檢測方法并應用于臨床。

1　材料和方法

1.1研究對象選取常州市第一人民醫(yī)院2017年4～10月各科室送檢的總計360例確診為細菌感染患者的胸腹腔積液，其中胸腔積液163例、腹腔積液197例。所有樣本均按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》留取、運送及保存。

1.2儀器及試劑PHOENIX微生物鑒定儀及配套試劑購自美國BD公司；MALDI-TOF MS檢測儀及配套的96孔不銹鋼靶板、IVD細菌測試標準品均購自德國Bruker公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)購自美國Sigma公司；哥倫比亞血瓊脂平板購自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司；營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)液購自杭州濱和微生物試劑有限公司。質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)，均購自美國Thermo Fisher公司。

1.3方法每份樣本分為三份，一份常規(guī)培養(yǎng)并使用微生物鑒定儀檢測；第二份離心集菌后用MALDI-TOF MS鑒定；第三份與營養(yǎng)肉湯混合后短期培養(yǎng)2 h，離心洗滌后用MALDI-TOF MS鑒定。以PHOENIX微生物鑒定儀檢測結(jié)果為標準，評估MALDI-TOF MS對短期培養(yǎng)后胸腹腔積液中致病菌的檢測效能。

1.3.1樣本的常規(guī)培養(yǎng)和鑒定：所有胸腹腔積液用分區(qū)劃線法接種于哥倫比亞血平板，5 ml/dl CO2孵箱中37℃培養(yǎng)18～24 h。菌落形成后挑取單個菌落配制成0.5麥氏單位的細菌懸液，使用PHOENIX微生物鑒定儀檢測。

1.3.2樣本直接MALDI-TOF MS鑒定前處理：取5 ml胸腹腔積液于無菌離心管中，2 000×g離心5 min去除細胞成分，將上層液體移至另一無菌離心管中；在20℃下12 000×g離心5 min沉淀細菌，棄上清后在沉淀物中加入1 ml生理鹽水洗滌；繼續(xù)20℃下12 000×g離心5 min，棄上清液后用加樣槍吸取1 μl沉淀均勻涂布于靶板孔內(nèi)，自然干燥后待用。

1.3.3短期培養(yǎng)樣本MALDI-TOF MS鑒定前處理：取1.5 ml胸腹腔積液和3 ml肉湯培養(yǎng)液于無菌離心管中充分混勻，2 000×g離心5 min沉淀細胞成分后置5 ml/dl CO2孵箱中37℃培養(yǎng)2 h。之后上清液高速離心沉淀細菌，加生理鹽水洗滌，取沉淀涂布靶板孔等步驟同1.3.2。

1.3.4MALDI-TOF MS鑒定：取1 μl甲酸水溶液對靶板孔內(nèi)的細菌進行裂解，室溫干燥。在每個孔位上覆蓋1 μl HCCA基質(zhì)液(含50 g/dl乙腈和2.5 ml/dl三氟乙酸的飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液)，自然干燥后放入用IVD標準品校正過的MALDI-TOF MS儀檢測。使用配套軟件Bruker Biotyper 3.0對得到的蛋白指紋圖譜與標準數(shù)據(jù)庫進行比對，得出分值用于判定檢測結(jié)果，評分>2.0為可鑒定到種水平，評分1.7～2.0為可鑒定到屬水平，評分<1.7為不可靠結(jié)果。本研究以1.7為界值，達到1.7認為細菌被正確檢出，未達到1.7即視為未檢出。

2　結(jié)果

2.1MALDI-TOF MS對胸腹腔積液短期培養(yǎng)和直接檢測的檢出率比較見表1。360例樣本以PHOENIX微生物鑒定儀的細菌鑒定結(jié)果為標準，直接MALDI-TOF MS檢測胸腔積液和腹腔積液的正確檢出率僅為66.3%和44.7%，總未檢出率高達45.6%；而經(jīng)過短期培養(yǎng)后兩種樣本的正確檢出率分別上升到94.5%和90.9%，總未檢出率只有7.5%。

表1

MALDI-TOF MS對胸腹腔積液短期培養(yǎng)和直接檢測的檢出率[n(%)]

2.2單一細菌胸腹腔積液PHOENIX微生物鑒定儀和短期培養(yǎng)后MALDI-TOF MS檢測結(jié)果的比較見表2。在360例胸腹腔積液中有322例為單一細菌生長，短期培養(yǎng)后MALDI-TOF MS檢測出322例樣本中的303例與PHOENIX常規(guī)培養(yǎng)的結(jié)果相同，其中只能鑒定到屬水平的細菌有15株，總體符合率達到了94.1%。322例樣本中有19例未能得到正確的鑒定結(jié)果。

表2

單一細菌胸腹腔積液PHOENIX鑒定和短期培養(yǎng)后MALDI-TOF MS的比較

注：*括號中數(shù)字表示相應細菌只鑒定到屬的株數(shù)。

2.3混合細菌胸腹腔積液PHOENIX微生物鑒定儀和短期培養(yǎng)后MALDI-TOF MS檢測優(yōu)勢菌結(jié)果的比較見表3。在360例胸腹腔積液中有38例為2種細菌混合生長，MALDI-TOF MS可以直接從胸腹腔積液中鑒定出優(yōu)勢生長的細菌，與常規(guī)培養(yǎng)鑒定得出的優(yōu)勢菌結(jié)果基本符合?；旌仙L的非優(yōu)勢菌主要為棒狀桿菌、惡臭假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、表皮葡萄球菌等常見污染菌。

表3

混合細菌胸腹腔積液PHOENIX鑒定儀和短期培養(yǎng)后MALDI-TOF MS檢測優(yōu)勢菌結(jié)果的比較

3討論基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)近年來憑借其快速準確、便捷經(jīng)濟的優(yōu)勢在微生物檢驗方面得到了廣泛的應用。已經(jīng)有很多國內(nèi)外學者對MALDI-TOF MS直接檢測臨床樣本中的致病菌進行了研究并取得了大量成果。Nonnemann等[3]使用商品化的預處理試劑盒從陽性血培養(yǎng)瓶中準確鑒定出了致病菌。有學者對單一細菌感染的98例中段尿樣本直接進行MALDI-TOF MS檢測，檢出率為75.5%；而對混合菌感染的中段尿樣本，優(yōu)勢菌的檢出率為68.8%[4]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展和細菌耐藥性的提升，臨床需進行細菌鑒定的胸腹腔積液數(shù)量呈上升趨勢，診療過程中得到的胸腹腔引流液在微生物檢測中的比重也越來越大。目前絕大多數(shù)研究都是直接檢測中段尿中的致病菌，而針對胸腹腔積液的研究鮮有報道[5]。因為首先與中段尿相比，胸腹腔積液的成分更復雜，常含有大量細胞和高含量蛋白，這些物質(zhì)對檢測細菌蛋白指紋圖譜的MALDI-TOF MS存在巨大干擾；其次是胸腹腔積液中的細菌含量相對中段尿來說普遍較低，易造成檢測圖譜峰數(shù)量過少[6]，特征峰不明顯，最終導致直接檢出率與中段尿相比明顯偏低[7]，鑒定結(jié)果無法令人滿意。

本研究在中段尿樣本直接檢測法的基礎上，針對胸腹腔積液的特點改進了檢測前的樣本處理方法：首先加入2倍樣本體積的肉湯培養(yǎng)液，混勻后低速離心，有效沉淀細胞和纖維蛋白等有形成分，然后孵育2 h讓細菌數(shù)量增加，最后高速離心并用生理鹽水洗滌得到的沉淀，就得到了足量高純度的細菌用于MALDI-TOF MS的檢測。March Rosselló等[8]對不同細菌濃度的中段尿樣本檢出率進行了研究，發(fā)現(xiàn)細菌數(shù)≥105cfu/ml時鑒定正確率很高，隨著細菌含量的減少正確率不斷下降，而當細菌數(shù)<104cfu/ml時基本上就無法得到正確的鑒定結(jié)果。本研究中360例胸腹腔積液直接檢測法檢出率只有54.4%，與樣本中細菌含量不足有關，經(jīng)過常規(guī)半定量培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)有約一半的樣本細菌含量在104～105cfu/ml之間。經(jīng)過短期培養(yǎng)后，MALDI-TOF MS檢測鑒定成功的樣本數(shù)達到了333例，其中310例評分超過了2.0分。未檢出樣本27例，其中有14例細菌含量<104cfu/ml；但同時也發(fā)現(xiàn)剩下的13例樣本雖然細菌含量>104cfu/ml，結(jié)果評分卻始終<1.7分。這些樣本外觀均呈粘稠乳糜狀，加入肉湯培養(yǎng)液孵育2 h后無論低速或高速離心均無法分離液體成分和固體微粒成分。查詢患者病歷資料及對樣本進行生化免疫檢測后發(fā)現(xiàn)，這些樣本均來自呼吸道或消化道惡性腫瘤患者，其胸腹腔積液中含有大量脂肪微粒，顯微鏡下可見脂肪微粒與細菌體積相近，僅靠離心無法將兩者分離。由于脂肪微粒對加入HCCA基質(zhì)液時細菌蛋白的結(jié)晶化有干擾，極大降低了蛋白的提取效率[9]，故MALDI-TOF MS無法得出正確的鑒定結(jié)果。

Wang等[10]通過研究表明，尿液樣本中兩種細菌的比例達到9∶1時，只有優(yōu)勢菌能被檢出；當兩種細菌含量在同一數(shù)量級時，它們的MALDI-TOF MS圖譜會相互影響，導致雙方的評分均偏低。本研究中有38例胸腹腔積液為混合菌生長，其中有8例分值<1.7分，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)確認8例樣本的兩種菌均接近1∶1的比例，臨床上也考慮混合感染；而其他30例樣本中優(yōu)勢菌都占七成以上，最終證實非優(yōu)勢菌均為取樣過程中造成的污染。這一結(jié)果與文獻相符，可以協(xié)助臨床對檢出細菌是否為污染菌作出判斷。

張景皓等[11]對中段尿標本使用血平板短期培養(yǎng)的方法提高了直接檢測的準確率，但4h的孵育時間與本研究使用液體培養(yǎng)基所需的2h相比仍然太久。雖然Demarco等[12]提出了一種透析過濾的方法，對胸腹腔積液進行脫鹽、分餾、富集等預處理，再使用MALDI-TOF MS檢測可達到100%的特異性，但必需使用特定的設備且操作較繁瑣并不適用于臨床大批量樣本的操作。

綜上所述，對胸腹腔積液進行2 h的肉湯短期培養(yǎng)，再進行MALDI-TOF MS能得到很高的正確檢出率。本方法在鑒定準確性、敏感性、操作便利性和時效性之間達到了一個很好的平衡，能比常規(guī)培養(yǎng)方法至少提早12 h出具報告，基本可以滿足臨床對胸腹腔積液作出快速細菌鑒定的要求。至于目前仍存在的無法檢測含大量脂肪微粒樣本的問題，可以尋找一種能夠吸附或者使脂肪變性的物質(zhì)，使脂肪微粒能夠聚集形成大分子結(jié)合物，最終分離得到純化的細菌，這也是后續(xù)研究的一個方向。相信隨著技術(shù)的繼續(xù)發(fā)展，研究的不斷深入和實驗操作標準化的持續(xù)完善，上述問題都能找到解決方法[13，14]，再加上MALDI-TOF MS在細菌耐藥性方面不斷取得新的成果[15]，病原微生物鑒定一定會進入質(zhì)譜分析的時代。

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