林麗慧，唐　梅，于春玲，林萬妹

(海南西部中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南那大　571799)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是一個(gè)極其復(fù)雜的多階段、多基因調(diào)控異常的過程[1]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)發(fā)生的高危因素，而CIN是宮頸癌的癌前病變，早期診斷和治療CIN對于預(yù)防宮頸癌有著重要的意義。研究表明，鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)及糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)對宮頸癌患者輔助診斷、病情監(jiān)測、預(yù)后評估具有一定的臨床價(jià)值[2]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-150與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，可能在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因的作用[3，4]。本研究通過檢測血漿miR-150，SCCA及CA125在HPV陽性宮頸癌患者中的表達(dá)情況，分析miR-150表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征間的關(guān)系，旨在為宮頸癌的早期診斷及靶向治療提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1研究對象選取2015年1月～2017年9月海南西部中心醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的HPV陽性宮頸癌患者108例(宮頸癌組)，年齡31～75(48.16±10.52)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)分類標(biāo)準(zhǔn)和WHO分級標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理確診為宮頸癌者；②選取高危型HPV(HR-HPV)陽性者，如HPV16，18，31，33，35，39，45；③術(shù)前均未接受放射治療、化療及生物免疫治療者。宮頸癌臨床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期51例，Ⅲ期13例，Ⅳ期5例；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌98例，腺癌10例；病理分級：G1 16例，G2 39例，G3 53例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移89例。另取同期與宮頸癌患者年齡匹配的HPV陽性宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變患者40例(CIN Ⅱ 13例，CIN Ⅲ 27例)作為CIN組和HPV單純陽性或HPV陽性子宮良性病變者40例作為對照組。所有研究對象均于清晨空腹抽取靜脈血5 ml，離心分離血漿后保存于-80℃冰箱待檢。

1.2儀器和試劑RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。貝克曼和羅氏電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒，化學(xué)發(fā)光法測定SCCA和CA125水平。

1.3miRNA逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR檢測取300 μl血漿樣本，加入1 ml總miRNA提取液，按照血液總miRNA快速提取試劑盒(miRNeasy血漿提取試劑盒)說明書從血漿中提取總RNA。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μl 100 mmol/L dNTPs(with dTTP)，1.00 μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/μl)，1.50 μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19 μl RNase抑制劑(20 U/μl)，4.16 μl無菌三蒸水。反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃保存，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，反應(yīng)體系為20 μl：1.00 μl TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液，10.00μl TaqMan⑧Universal PCR Master MixⅡ(2×)溶液，1.33 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7．67μl DEPC水。擴(kuò)增條件為：95℃10 min 1個(gè)循環(huán)，95℃ 15 s，60℃60 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值的經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-150的相對表達(dá)水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

2　結(jié)果

2.1各組血漿miR-150，SCCA及CA125表達(dá)水平比較見表1。宮頸癌組血漿miR-150，SCCA及CA125表達(dá)水平均明顯高于CIN組和對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CIN組血漿miR-150表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1

各組血漿miR-150，SCCA及CA125表達(dá)水平比較

2.2HPV陽性宮頸癌患者血漿miR-150表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見表2。隨著宮頸癌臨床分期的進(jìn)展，miR-150表達(dá)水平逐漸升高，Ⅲ～Ⅳ期HPV陽性宮頸癌患者中miR-150表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血漿miR-150表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度也相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、病理類型、病理分級、腫瘤大小及絕經(jīng)狀態(tài)無關(guān)(P>0.05)。

表2

HPV陽性宮頸癌患者血漿

2.3血漿miR-150，SCCA及CA125對HPV陽性CIN的診斷價(jià)值見圖1和表3。血漿miR-150，SCCA及CA125診斷HPV陽性CIN的曲線下面積(AUC)及95%CI分別為0.830(0.750～0.906)，0.703(0.625～0.781)，0.624(0.547～0.698)，與對照組(AUC=0.5)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血漿miR-150診斷HPV陽性CIN的最佳截值為3.46，敏感度和特異度為81.0%和80.2%。

圖1　血漿miR-150，SCCA及CA125診斷HPV陽性CIN的ROC曲線

表3

血漿miR-150，SCCA及CA125對HPV陽性CIN的診斷價(jià)值

2.4血漿miR-150，SCCA及CA125對HPV陽性宮頸癌的診斷價(jià)值見圖2和表4。

圖2　血漿miR-150，SCCA及CA125診斷HPV陽性宮頸癌的ROC曲線

血漿miR-150，SCCA及CA125診斷HPV陽性宮頸癌的曲線下面積(AUC)及95%CI分別為0.881(0.801～0.964)，0.780(0.712～0.863)，0.679(0.602～0.754)，與對照組(AUC=0.5)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血漿miR-150診斷HPV陽性宮頸癌的最佳截值為8.25，敏感度和特異度為87.0%和84.3%。

2.5多元Logistic回歸分析血漿miR-150，SCCA，CA125與HPV陽性宮頸癌的關(guān)系見表5。把宮頸癌組與對照組作為二分變量，以miR-150，SCCA及CA125作為自變量，應(yīng)用多元Logistic回歸模型對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，血漿miR-150和SCCA水平升高是HPV陽性宮頸癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[OR(95%CI)=2.107(1.915～2.814)，OR(95%CI)=1.583(1.327～2.036)]。

表4

血漿miR-150，SCCA及CA125對HPV陽性宮頸癌的診斷價(jià)值

3討論微小核糖核酸(microRNA，miR)是一類由18～25個(gè)核苷酸小分子組成的非編碼單鏈小RNA，在腫瘤生理病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，有望成為一種新的疾病診斷、分類和預(yù)后判斷的工具[5]。HPV檢測是臨床上篩查宮頸癌的常用方法，而HR-HPV與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。HR-HPV主要通過早期表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白作用于宿主細(xì)胞的microRNA，引起宿主細(xì)胞生物學(xué)行為改變，進(jìn)而導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生癌變。有研究證實(shí)，血漿miR-150在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，是診斷惡性腫瘤患者的特異性標(biāo)記物[7]。然而，血漿miR-150能否作為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志物，目前尚未明確。

表5

多元Logistic回歸分析血漿miR-150，

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組血漿miR-150，SCCA及CA125表達(dá)水平均明顯高于CIN組和對照組，CIN組血漿miR-150表達(dá)水平明顯高于對照組，Ⅲ～Ⅳ期患者血漿miR-150的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期。提示miR-150水平與宮頸癌的病情進(jìn)展密切相關(guān)，可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。Yin等[8]研究表明，miR-150對腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡及機(jī)體腫瘤免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮著重要的作用，并與惡性腫瘤的預(yù)后判斷、臨床病理分期及轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。Ghose等[9]研究認(rèn)為，宮頸癌患者miR-150表達(dá)水平異常升高，miR-150通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。另有研究表明，miR-150表達(dá)水平上調(diào)與宮頸癌組織中臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、HPV感染和生存情況相關(guān)，它可以作為宮頸癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[10]。此外，進(jìn)一步分析miR-150表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度>1/2肌層的宮頸癌患者miR-150表達(dá)水平明顯升高，提示miR-150與HPV陽性宮頸癌患者的病情進(jìn)展有關(guān)，分析其原因可能是存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者腫瘤負(fù)荷往往較大，腫瘤組織可釋放更多的具有原癌基因作用的microRNA進(jìn)入血液，同時(shí)可抑制機(jī)體原有的具有抑癌作用的microRNA水平表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體microRNA表達(dá)水平異常升高；浸潤越深的患者病情進(jìn)展越快，腫瘤組織microRNA表達(dá)水平升高越明顯。Li等[11]研究也證實(shí)，miR-150是宮頸癌病理過程的重要調(diào)節(jié)因子，miR-150上調(diào)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，miR-150下調(diào)可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長。

筆者應(yīng)用ROC曲線分析，結(jié)果顯示血漿miR-150對HPV陽性宮頸癌和CIN的診斷效能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物SCCA和CA125，其敏感度和特異度均較高。說明血漿miR-150在HPV陽性宮頸癌的早期診斷和CIN鑒別診斷方面具有一定的臨床價(jià)值。Wang等[12]研究表明，microRNA作為一種新的生物標(biāo)志物，可用于監(jiān)測宮頸癌的進(jìn)展和診斷HPV感染導(dǎo)致的宮頸癌。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，microRNA異常高表達(dá)與CIN分級和宮頸癌相關(guān)，是宮頸癌早期診斷和預(yù)后判斷的可靠生物學(xué)標(biāo)志物。本研究中，血漿miR-150和SCCA水平升高是HPV陽性宮頸癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而與年齡、病理類型、病理分級、腫瘤大小及絕經(jīng)狀態(tài)無關(guān)。提示miR-150可獨(dú)立作為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志物。Liang等[14]研究認(rèn)為，microRNA的異常表達(dá)與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、化療耐藥性以及整體生存情況明顯相關(guān)，它可以作為宮頸癌預(yù)后的重要評判指標(biāo)。He等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，miR-150在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用，有望成為宮頸癌早期診斷的潛在標(biāo)志物。另有研究表明，血漿miR-150高表達(dá)對惡性腫瘤的總生存率有顯著影響，它可作為惡性腫瘤診斷和預(yù)后評估的一種新型腫瘤標(biāo)志物[16]。由此可見，血漿miR-150檢測可作為宮頸癌篩查和輔助診斷方法，在HPV陽性宮頸癌中具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，血漿miR-150在HPV陽性宮頸癌患者中明顯上調(diào)，與SCCA和CA125傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物相比，其診斷HPV陽性宮頸癌的敏感度和特異度均較高，有望作為HPV陽性宮頸癌早期診斷和CIN鑒別診斷的新型分子標(biāo)志物。但miR-150在宮頸癌的研究尚處于早期階段， 有關(guān)miR-150表達(dá)異常在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制及其調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

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