劉宇豪，陳　晨，次仁曲珍，周俊英，3　(.武漢大學(xué)，武漢　43007；

2.西藏山南婦幼保健院，西藏山南　856000；3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢　430071)

由于抗生素的不合理使用，細(xì)菌對抗生素的耐藥率越來越高，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)檢出率也逐年遞增，CRE耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，已在世界范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注[1，2]。本研究通過對中南醫(yī)院CRE耐藥菌株分布及耐藥基因的分析，為CRE的感染控制提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1菌株來源收集2015～2017年武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科保存的53株CRE。

1.2主要試劑Taq酶(美國Fermentas公司)，dNTP(湖北晶茂生物技術(shù)公司)，DNA Marker 100bp(廣州東盛生物科技)，6×Loading Buffer(大連TaKaRa公司)，細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒(北京莊盟公司)，Goldview核酸染料(北京賽百盛生物工程公司)。

1.3PCR引物合成KPC，IMP，OXA-48，VIM和NDM 5種引物由北京擎科公司合成，引物系列見表1。

表1

檢測碳青霉烯酶基因所用的PCR引物

注：*Y=C or T。

1.4PCR反應(yīng)條件blaKPC及blaIMP的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，55℃ 退火40 s，72℃延伸50 s，共36個(gè)循環(huán)，最后72℃5 min。blaOXA，blaVIM及blaNDM的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；94℃30 s，58℃40 s，72℃50 s，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

1.5藥敏試驗(yàn)按梅里埃藥敏卡AST-13說明書進(jìn)行。

1.6CRE表型刪選實(shí)驗(yàn)采用改良Hodge試驗(yàn)。

1.7CRE菌株基因組DNA提取按照試劑說明書進(jìn)行。

1.8PCR擴(kuò)增體系總體積為25 μl，包含DNA模板2 μl，MgCl225 mmol/L 2.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，上、下引物各為1 μl，10×PCR緩沖液2.5 μl，DNA聚合酶(5 U/μl)1 μl，雙蒸水14.5 μl。

1.9耐藥性分析采用WHONET5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1CRE菌株的分布53株CRE菌株中，肺炎克雷伯菌34株占64.15%，大腸埃希菌12株占22.64%，陰溝腸桿菌7株占13.21%；科室分布為重癥監(jiān)護(hù)病房15株CRE占28.30%，呼吸內(nèi)科病房9株占16.98%，干部病房6株占11.32%，其余科室23株占43.40%；標(biāo)本類型為尿液標(biāo)本20株CRE占37.74%，痰液16株占30.19%，引流液9株占16.98%，傷口分泌物4株占7.55%，血液2株占3.77%，腦脊液2株占3.77%。

2.2CRE的耐藥率2016年送檢標(biāo)本中，檢出肺炎克雷伯菌811株，CRE 69株，檢出率為8.51%；大腸埃希菌1 581株，CRE 33株，檢出率為2.09%；陰溝腸桿菌225株，CRE 15株，檢出率為6.67%。耐碳青霉烯類的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌耐藥情況見圖1，圖2。

圖1　肺炎克雷伯菌耐藥率(%)

圖2　大腸埃希菌耐藥率(%)

2.3亞胺培南、美羅培南和厄他培南3種藥敏紙片的改良Hodge試驗(yàn)53株CRE菌株中，改良Hodge試驗(yàn)陽性株有31株，占58.49%。其中亞胺培南、美羅培南和厄他培南3種藥敏紙片的Hodge試驗(yàn)結(jié)果一致，見圖3。

2.4CRE菌株耐藥相關(guān)基因擴(kuò)增結(jié)果31株CRE中，攜帶blaKPC(798bp)基因有29株，檢出率96.67%，攜帶blaNDM (621bp)基因有9株，檢出率29.03%，同時(shí)擴(kuò)增出blaKPC和blaNDM基因有8株，檢出率25.81%，未擴(kuò)增出blaIMP，blaOXA，blaVIM基因，見圖4，圖5。

圖3　改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果示意圖

圖4　blaKPC電泳結(jié)果示意圖

圖5　blaNDM基因型電泳結(jié)果示意圖

3討論藥敏結(jié)果顯示，CRE對碳青霉烯類、頭孢菌素類、氨曲南和氟喹諾酮類等抗菌藥物耐藥率較高，對慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、復(fù)方新諾明、替加環(huán)素等抗菌藥物耐藥率較低。治療CRE感染時(shí)，建議臨床優(yōu)先考慮替加環(huán)素，或替加環(huán)素與氨基糖苷類抗生素聯(lián)合使用。

改良Hodge試驗(yàn)是CLSI推薦檢測碳青霉烯酶表型的篩查方法，本實(shí)驗(yàn)53株CRE中，Hodge試驗(yàn)陽性31株，其陽性菌株少的原因可能與某些菌株產(chǎn)碳青霉烯酶量較低有關(guān)[3]。Hodge試驗(yàn)采用亞胺培南、美羅培南和厄他培南3種藥敏紙片，其試驗(yàn)結(jié)果一致，但觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：厄他培南和美羅培南矢狀箭頭較為明顯，亞胺培南不及它們明顯，因此建議Hodge試驗(yàn)時(shí)，首選厄他培南或美羅培南紙片。

在藥物選擇壓力下，CRE攜帶耐藥基因的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可發(fā)生水平傳播[4]，抗菌藥物選擇壓力不僅能使耐藥基因廣泛傳播，而且會(huì)促進(jìn)耐藥基因通過突變、插入序列等方式，使自身基因發(fā)生變化，進(jìn)而使耐藥性發(fā)生改變，引起耐藥基因的傳播[5]。本研究中發(fā)現(xiàn)1株不常見耐藥基因型，推測該菌株可能攜帶一種新的耐碳青霉烯酶基因，因此建議擴(kuò)大耐藥基因檢測范圍，或者測序進(jìn)一步確認(rèn)該菌株的基因型。31株耐藥基因分析中，CRE基因型主要是KPC，其次是NDM，這與目前國內(nèi)及世界范圍內(nèi)，腸桿菌科細(xì)菌攜帶碳青霉烯酶基因?yàn)镵PC-2和NDM-1一致[6]。重癥醫(yī)學(xué)科和呼吸內(nèi)科病房檢出的CRE主要是肺炎克雷伯菌，耐藥基因型主要是KPC型，干部病房CRE主要是大腸埃希菌，耐藥基因型主要是KPC和NDM的混合型。醫(yī)院應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)對這些科室CRE的監(jiān)管力度，嚴(yán)格控制臨床醫(yī)生合理使用抗生素，特別是碳青霉烯類藥物的用藥指征，防止CRE區(qū)域性傳播。

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