江　凡，王飛玲，路瑞靜，周喜友，鄒建話

(深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東深圳　518101)

B族鏈球菌(group BStreptococcus，GBS)是一種寄生于人類下消化道和泌尿生殖道的細(xì)菌，在成年女性的陰道和直腸中帶菌率可達(dá)15%～40%，是圍產(chǎn)期感染的首要病原菌之一。研究表明，孕婦GBS感染易發(fā)生胎膜早破、羊膜腔感染、晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)及產(chǎn)褥感染等。新生兒GBS感染最常表現(xiàn)為肺炎和敗血癥，部分早發(fā)型(出生6天內(nèi))新生兒可表現(xiàn)為腦膜炎，病死率高達(dá)10%，由宮內(nèi)垂直感染所致；晚發(fā)型(生后7～30天)主要表現(xiàn)為腦膜炎和菌血癥，發(fā)病率和病死率約2%～6%，由出生后水平傳播感染所致，約50%的晚發(fā)型感染遺留不同程度的后遺癥，包括癲癇、腦積水、聽力喪失和語言發(fā)育遲緩等[1，2]。

GBS血清型與疾病的嚴(yán)重程度和疫苗的設(shè)計(jì)密切相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)10種GBS莢膜多糖血清型：Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ和Ⅸ型。分子分型技術(shù)對流行病學(xué)研究較血清學(xué)分型具有更強(qiáng)的鑒別能力[2]。因?yàn)檫@些菌株一般含有需要的基因[3]。GBS有許多毒力因子和毒素，有助于GBS進(jìn)入宿主細(xì)胞，其中包括表面蛋白、毒素和水解酶。C5a肽酶(SCPB)、Laminin結(jié)合蛋白(Lmb)、C蛋白的alpha和beta亞單位(Bca和Bac)和Rib蛋白。目前對GBS的流行病學(xué)研究、藥物敏感的評估和血清學(xué)分型在國內(nèi)開展較少，GBS的分子分型和毒力鑒定亦不多見。本研究旨在分析深圳地區(qū)GBS的血清型分布、藥敏特點(diǎn)和毒力基因的鑒定；了解深圳地區(qū)GBS流行病學(xué)，為將來GBS疫苗的研制提供參考。

1　材料和方法

1.1研究對象515例GBS純培養(yǎng)物來自深圳市四家醫(yī)院門診和住院患者(其中大部分來自深圳寶安區(qū)婦幼保健院)，其中54例(10.5%)來自新生兒，所有患者出現(xiàn)早發(fā)疾病(EOD)(<7天)，已知一大半新生兒(64%)有GBS細(xì)菌血癥；461例分離株(89.5%)來自成人(年齡范圍20～87歲)。在未懷孕的成人中(n=215)，GBS分離株常分離于血液(37.3%)、陰道(35%)、傷口和化膿標(biāo)本(26%)，僅5例來自尿液標(biāo)本(1.7%)。對于孕婦(n=246)樣本中，絕大多數(shù)GBS分離株來自陰道標(biāo)本(90%)，少量標(biāo)本來自血液、尿液和胎盤(共占10%)。根據(jù)臨床結(jié)果和分離的部位把分離株分成三組：侵襲性(n=108)，來自正常人體的無菌部位；非侵襲性(n=112)來自傷口、皮膚潰瘍、氣管和胃抽吸物；其它來自陰道拭子和無癥狀的尿液標(biāo)本克隆的分離株(n=295)。除了115例標(biāo)本GBS和其它微生物共存(金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性的葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、克雷伯菌屬和非特異性和特異性球菌)，其余均為純的GBS培養(yǎng)物。菌株的鑒定是基于培養(yǎng)鑒定、G染色、觸酶試驗(yàn)和CAMP試驗(yàn)，所有操作參照《臨床微生物鑒定手冊》。分離株的種特性用玻片凝聚(Murex Diagnostics，UK)和用PCR鑒定cfb基因(編碼CAMP因子)進(jìn)一步證實(shí)。所有菌株保存在菌種保存管中，-80℃長期保存，4℃短期保存在5 ml/dl血瓊脂糖平板。

1.2研究方法

1.2.1血清分型：用型特異的抗血清乳膠凝聚方法試劑盒(Statens Serum Institute，SSI，Sweden)對上述GBS分離株血清分型(Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ～Ⅸ)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書。不與任何一種抗血清反應(yīng)的菌株被歸類為血清學(xué)不能分型(NT)菌株。

1.2.2PCR分型：所有GBS分離株DNA的提取采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(天根生物有限公司)，DNA的濃度用微量核酸檢測儀分析，提取后的DNA用TE緩沖液保存在-80℃冰箱。GBS的基因分型采用常規(guī)的PCR反應(yīng)，所有引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。GBS參考株A909(type Ⅰa)，H36B(type Ⅰb)，18RS21(type Ⅱ)，M78(type Ⅲ)，CNCTC 1/82(type Ⅳ)，BAA-611(type Ⅴ)，NT6(type Ⅵ)，7271 SSI(type Ⅶ)由深圳市寶安區(qū)婦幼保健院吳麗娟博士提供。

1.2.4毒力基因：所有GBS分離株檢測7個毒力基因，即scpB，lmb，hylB，cylE，bac，bca和編碼C5a多肽酶的rib基因。引物和PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[4～6]。具有上述基因的GBS參考菌株ATCC 13813(cfb)，ATCC BAA-611(rib)，NCTC 11078(bca和bac)，ATCC12403(cylE)，ATCC12386(lmb和scpB)和無乳鏈球菌4755(hylB)作為陽性對照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；χ2檢驗(yàn)獨(dú)立用于變異之間的關(guān)聯(lián)性。組別之間采取t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示；所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均使用α=0.05的雙側(cè)檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時被視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血清分型(CS)和分子分型(MS)的比較見表1。在515例GBS樣本中，能夠用血清分型鑒定為Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ和Ⅸ血清型的共有470例，占80.6%，45例(8.7%)分離株不能被分型，占8.7%。515例GBS分離株全部能夠被分子分型(MS)進(jìn)行分型，MS可檢測所有GBS衣殼血清型基因。在血清分型不能鑒定的45例分離株中，15例分離株為血清型Ⅲ，而其余的30例分離株為血清型Ia。分子方法分型結(jié)果顯示，血清型Ⅲ是最常見的莢膜型(56.5%)，然后依次為Ⅰb(17.5%)，Ⅰa(12.6%)，Ⅴ(7.4%)，Ⅱ(2.7%)，Ⅵ(1.4%)，Ⅳ(1.0%)和Ⅸ(1.0%)。血清分型和分子分型的結(jié)果詳見表1。在本研究中沒有檢測到血清型Ⅶ和Ⅷ的分離株。

表1

GBS樣本血清分型和分子分型

針對不同人群特征，我們對Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ和Ⅸ血清型八種基因型進(jìn)行了分類，分別為侵襲性、非侵襲性及定植株。不同血清型在侵襲性人群、非侵襲性人群及定植人群中表達(dá)不同，Ⅲ型為主要血清型，分別為65.7%，42.0%和58.6%。除Ⅲ型外，在侵襲性和非侵襲性感染人群中，血清型Ⅰa也較為常見(11.1%和29.5%)，Ⅰb在定植人群中較為常見(19.3%)。詳見表2。

表2

GBS人群的分子分型分布[n(%)]

2.2藥敏試驗(yàn)515例GBS樣本藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：所有GBS分離株對青霉素、氨芐青霉素、頭孢呋辛、頭孢曲松和萬古霉素敏感。E試驗(yàn)證實(shí)了GBS對青霉素100%敏感，MIC范圍為0.023～0.064 μg/ml。多數(shù)分離株(n=443，86.0%)對四環(huán)素耐藥；345例分離株(67.0%)對紅霉素耐藥；319例(61.9%)對克林霉素耐藥，其中319例克林霉素耐藥的分離株中有15例顯示為可誘導(dǎo)性克林霉素耐藥分離株。

2.3毒力基因四種主要的毒力基因編碼β-溶血素/細(xì)胞裂解素(β-H/C)、層黏結(jié)合蛋白、C5a多肽酶和透明質(zhì)酸裂解酶(cylE，lmb，scpB和hylB)。幾乎所有的GBS分離株中可以檢測到cylE，lmb，scpB和hylB基因，檢出率分別為97.1%，97.1%，96.1%和94.2%。另外三個毒力基因型(bac，bca，rib)的分布和各種血清型關(guān)系見表3。

表3

275例GBS分離株衣殼血清

3討論本研究是針對深圳地區(qū)人群B群鏈球菌血清型分布、毒力基因和耐藥性分析的前瞻性研究，國內(nèi)同類研究報道較少。在本研究中，515例GBS分離株用血清分型和分子分型方法進(jìn)行分型，并且對其進(jìn)行藥敏分析。血清分型可以對470例標(biāo)本進(jìn)行分型，分子分型可以對所有GBS樣本進(jìn)行分型。相當(dāng)比例分離株不能用常規(guī)的血清分型鑒定，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報道[7]相一致(8.7%)。血清分型相對經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，操作簡單，但存在一定的局限性，不能對所有分離株進(jìn)行分型；分子分型能準(zhǔn)確對所有分離株進(jìn)行分型，效率高，但經(jīng)濟(jì)耗費(fèi)相對昂貴。

杜月笙十五歲闖蕩上海灘，因?yàn)樯朴谧プC(jī)會，才能從水果店學(xué)徒混進(jìn)黃公館。因?yàn)橹亓x氣、有遠(yuǎn)見、做事有魄力，很快獲得黃金榮賞識，從眾多門人中脫穎而出。

本研究中，515例深圳地區(qū)GBS分離菌株中，共發(fā)現(xiàn)8種血清型，其中血清型Ⅲ在GBS分離株中最為多見(56.5%)，其次是血清型Ⅰb(17.5%)和Ⅰa(12.6%)。對分離菌株進(jìn)行人群分布，發(fā)現(xiàn)在不同的人群中，Ⅲ型為主要血清型。除Ⅲ型外，在侵襲性和非侵襲性感染人群中，血清型Ⅰa也較為常見(11.1%和29.5%)，Ⅰb在定植人群中較為常見(19.3%)。本研究中，血清型Ⅳ，Ⅵ和Ⅸ檢出數(shù)較少，且未發(fā)現(xiàn)血清型Ⅶ，Ⅷ，與相關(guān)文獻(xiàn)[8，11]報道一致。

本研究藥敏結(jié)果表明，所有GBS分離株對β-內(nèi)酰胺敏感，沒有檢測到青霉素耐藥或中度耐藥的菌株。但有研究者已鑒定到對青霉素敏感性減弱的GBS菌株[7，9]。因此，青霉素是否可作為分娩期預(yù)防和治療GBS的一線藥物仍有待于進(jìn)一步研究。我們的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥率較高，與相關(guān)報道一致[10，15]。因此，對于那些對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素過敏的孕婦，在選用紅霉素和克林霉素時，一定要參考相關(guān)藥敏結(jié)果。

在本研究中，275例GBS樣本中可以檢測到rib基因，bac基因和bca基因，其血清分型分別為Ⅰa，Ⅰb，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅵ和Ⅸ。其中rib基因檢出率最高，占總數(shù)的54.5%，同歐美類似，但高于在波蘭和科威特孕婦中的報道[10]。來自東南亞和歐洲的報道指出rib基因與血清型Ⅰa，Ⅱ和Ⅲ密切相關(guān)[12～14]，但在我們的研究中，rib在血清型Ⅲ中表達(dá)最高，其次是Ⅰb和Ⅰa，較為相似。此次研究中bca和bac基因主要分布在血清型Ⅲ和Ⅰb中，比例分別為68%，24%和50%，36%。在Meehan等[14]的一個研究中，約50%的血清型Ⅲ分離株含bac基因或bca基因或兩種基因同時存在，這與我們的研究結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，30～55%血清型Ⅰa的GBS分離株含bca基因[5]，但在我們的研究中Ⅰa血清型分離株含bca基因比例略低(5.3%)。以上這些結(jié)果表明毒力基因和GBS的血清分型之間存在相關(guān)性，但也存在地理差異與環(huán)境影響。

綜上所述，分子分型和常規(guī)血清分型各有優(yōu)缺點(diǎn)，但分子分型更有推廣價值，GBS分離株對青霉素和頭孢類藥物敏感，較多分離株對四環(huán)素、紅霉素和克林霉素耐藥。毒力基因與GBS的分型存在一定的相關(guān)性，但GBS的毒力和基因之間相互作用有待于進(jìn)一步研究。另外，本研究不能證明毒力基因和GBS感染患者臨床狀態(tài)之間的相關(guān)性。

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