邱　巍，胡　威，趙建江，陳素梅，劉東聲

(宿遷市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇宿遷　223800)

1　材料和方法

1.1研究對(duì)象血液樣本來源于2016年1月～2017年12月在江蘇省宿遷市人民醫(yī)院腫瘤科接受治療的食管癌患者246例，其中男性177例，女性69例，平均年齡68.14±8.91歲。對(duì)照組為健康體檢者樣本240例，其中男性158例，女性82例，平均年齡58.51±7.94歲，排除腫瘤及其他全身性疾病。樣本均來自江蘇宿遷地區(qū)漢族人群。本研究由宿遷市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與人員知情同意。

1.2試劑與儀器TIANamp Blood DNA Kit全血基因組提取試劑盒(北京天根生化公司)， TaKaRa Ex Taq PCR試劑盒、內(nèi)切酶和引物(大連寶生物公司)。T100 PCR儀(美國伯樂公司)，F(xiàn)R980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技公司)，DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)，Centrifuge 5424R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提?。翰捎肨IANamp Blood DNA Kit提取所有樣本的全血基因組DNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測全血基因組DNA的質(zhì)量。

1.3.2基因多態(tài)性分析：-149C>T和-579G>T位點(diǎn)的基因型運(yùn)用PCR-RFLP法檢測。-149C>T上游引物為5’-TGCTGTGACAGGCAGAGCAG-3’，下游引物為5’-GGTAGCCGGGAACTCCACGG-3’。-579G>T上游引物為5’-GAGGTCTCATTATGCCTAGG-3’，下游引物為5’-GGGAGCTCACCTTCTAGAAA-3’。PCR反應(yīng)體系見參考文獻(xiàn)[2，3]。-149C>T擴(kuò)增產(chǎn)物采用TAKARA Blnt I酶切試劑盒體系進(jìn)行限制性酶切，-579G>T擴(kuò)增產(chǎn)物使用TAKARA Pvu II酶切試劑盒體系進(jìn)行限制性酶切。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)食管癌組和對(duì)照組進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行各基因型頻率的比較，Logistic回歸模型計(jì)算比值比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1基因分型結(jié)果-149C>T PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為380 bp，基因型CT可被Blnt I部分切開，見380，207和173 bp三個(gè)片段，基因型TT可被完全切開，見207和173 bp兩個(gè)片段，見圖1。

1：MarkerⅠ；2，3：TT型.207 bp/173 bp；4，5：CT型.380 bp/207 bp/173 bp；6：PCR產(chǎn)物.380 bp。

圖1DNMT3B -149C>T擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

-579G>T PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為225 bp，基因型GT可被Pvu II部分切開，見225，132和93 bp三個(gè)片段，基因型TT可被完全切開，見132和93 bp兩個(gè)片段，基因型GG不能被切開，見225 bp片段，見圖2。

1：MarkerⅠ；2：GG型.225 bp；3：GT型.225 bp/132 bp/93 bp；4：TT型.132 bp/93 bp；5：PCR產(chǎn)物.225 bp。

圖2DNMT3B -579G>T擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2基因多態(tài)性分布比較經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，各組基因型頻率均符合遺傳平衡定律，具備群體代表性。在-149C>T位點(diǎn)中，經(jīng)Logistic回歸校正年齡、性別后，基因型TT與CT在食管癌組和對(duì)照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.089，P>0.05)。按年齡分組后，≥60歲分組和<60歲分組中TT與CT基因型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。按性別分組后，在男性和女性分組中基因型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。在-579G>T位點(diǎn)中，經(jīng)Logistic回歸校正年齡、性別后，基因型TT與GT+GG在食管癌組和對(duì)照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.649，P>0.05)。按年齡分組后，≥60歲分組和<60歲分組中基因型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.491～0.876，均P>0.05)。按性別分組后，在男性和女性分組中基因型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.044～0.646，均P>0.05)，見表2。

3討論DNA甲基化是被最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾，其過程是將一個(gè)甲基加到DNA腺嘌呤或胞嘧啶上的修飾過程[4]?；虻募せ詈褪Щ钤趥€(gè)體的發(fā)育過程中是非常復(fù)雜的過程。基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化水平可影響腫瘤抑制基因的表達(dá)[5]。

DNMT3B -149C>T多態(tài)性已在多種腫瘤中報(bào)道過，本研究中的食管癌組TT基因型為98.0%，與對(duì)照組TT基因型98.3%分布幾乎相同，在Zhang等[6]對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌的研究中，喉鱗狀細(xì)胞癌TT基因型為35.0%，顯著高于對(duì)照組TT基因型(21%)，在Hu等[7]對(duì)胃癌的研究中，胃癌TT基因型為99.2%，對(duì)照組TT基因型為98.9%，在Qian等[8]對(duì)結(jié)直腸癌的研究中，結(jié)直腸癌TT基因型為98.9%，對(duì)照組TT基因型為97.7%，這表明在漢族人群中-149C>T與食管癌、胃癌和結(jié)直腸癌無相關(guān)性，而與喉鱗狀細(xì)胞癌有相關(guān)性。DNMT3B -579G>T多態(tài)性與腫瘤易感性關(guān)系也曾報(bào)道過，本研究中食管癌組TT基因型為80.1%，其分布與正常對(duì)照組TT基因型77.1%一致，而在Wang等[9]對(duì)胃癌的研究中，胃癌TT基因型為80.5%，與對(duì)照組TT基因型83.4%無差異，在Qian等[8]對(duì)結(jié)直腸癌的研究中，結(jié)直腸癌TT基因型為90.1%，顯著高于對(duì)照組TT基因型(81.8%)，表明在漢族人群中-579G>T與食管癌和胃癌無相關(guān)性，而與結(jié)直腸癌有相關(guān)性。這說明在不同的腫瘤中DNMT3B的不同剪切子催化活性有差異。DNMT3B在腫瘤發(fā)生過程中的機(jī)制還需要進(jìn)一步闡明。

表1

DNMT3B -149C>T基因型頻率分析[n(%)]

注：a，用Fisher確切概率法分析。

表2

DNMT3B-579G>T基因型頻率分析[n(%)]

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