趙英倫，馬　元，莫　森，李東冉，王　軍，劉　沖，詹新立

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，南寧　530021)

腰椎間盤退行性病變是腰椎間盤突出癥(prolapse of lumbar intervertebral disc，lumbar intervertebral disc hernia)的發(fā)病基礎(chǔ)，在外力因素作用下，導(dǎo)致椎間盤纖維環(huán)破裂，髓核于破裂處突出壓迫后方神經(jīng)，使患者在不同程度上產(chǎn)生腰痛及坐骨神經(jīng)痛。隨著人們工作模式及生活方式的改變，腰椎間盤退行性病變?cè)桨l(fā)趨于年輕化，腰椎間盤突出癥患者及潛在患者也逐年增加，而其治療方法相對(duì)局限，主要包括藥物保守治療、康復(fù)治療、手術(shù)治療等，尚不能完全緩解腰椎間盤突出癥引起的腰腿痛。因此，尋找新的治療方法迫在眉睫。早年觀點(diǎn)認(rèn)為，椎間盤退變是一種形態(tài)學(xué)改變，主要表現(xiàn)為長(zhǎng)期反復(fù)的外力造成的生物力學(xué)失穩(wěn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡異常在腰椎間盤退變過(guò)程中扮演著重要的角色[1]，是腰椎間盤突出癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要病因機(jī)制，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中具有核心調(diào)控作用，但腰椎間盤突出癥患者體內(nèi)caspase-3和caspase-9活性變化尚未見報(bào)道。

1　材料和方法

1.1研究對(duì)象選取2014年12月～2016年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科住院手術(shù)治療的腰椎間盤突出癥患者99例，其中單一節(jié)段腰椎間盤突出癥患者70例(A組)，男∶女=40∶30，平均年齡45.59±1.10歲；多節(jié)段腰椎間盤突出癥患者(突出節(jié)段≥2個(gè))29例(B組)，男∶女=18∶11，平均年齡49.03±1.43歲；同時(shí)隨機(jī)選取我院健康體檢者40例作為正常對(duì)照組，男∶女=24∶16，平均年齡44.55±1.65歲；于入院次日采集外周靜脈血，將分離出的血清存放于-78℃。各組之間年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.091，P=0.91)。各組間性別構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.229，P=0.892)。入選標(biāo)準(zhǔn)： A，B組患者須滿足CT或MRI診斷僅為腰椎間盤突出癥，且不同程度上具有腰腿痛，術(shù)后病理回報(bào)為退變椎間盤組織，所有患者及正常對(duì)照組人群均排除急/慢性炎癥、骨折、椎體滑脫、心臟、肝臟、腎臟、結(jié)核、腫瘤及內(nèi)分泌病史，無(wú)其他合并癥及并發(fā)癥。

1.2試劑和儀器人半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶caspase-3，9試劑盒(ELISA)購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司，試劑盒包括：標(biāo)準(zhǔn)品(100 ng/L)1.8 ml、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液6 ml，樣品稀釋液6 ml，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)10 ml，20×濃縮洗滌液25 ml，顯色劑A液6ml，顯色劑B液6ml，終止液6ml。使用A450nm酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)各組血清中caspase-3，9濃度。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔及待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作A450 nm的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加待測(cè)樣品50 μl，標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣品孔加入100 μl的HRP，空白孔除外。封膜后于37℃恒溫箱溫育60 min。洗板5次，加入顯色液A，B。37℃避光顯色15 min。加入終止液，10 min后立即讀取吸光度(A)值。最后根據(jù)樣品的A值在450nm標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的caspase-3，9濃度。

2結(jié)果血清caspase-3，caspase-9濃度在正常對(duì)照組、A組和B組呈遞增趨勢(shì)，見表1。A組(q=3.08，3.29，均P<0.05)、B組(q=5.78，4.50，均P<0.05)caspase-3，caspase-9濃度均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且B組高于A組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.21，3.22，均P<0.05)。

表1

各組血清caspase-3，caspase-9濃度比較

3討論細(xì)胞凋亡是指機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由多種基因調(diào)控的細(xì)胞自主性程序性死亡，其意義在于清除體內(nèi)衰老、感染、變異等異常細(xì)胞。正常情況下，細(xì)胞增殖應(yīng)與細(xì)胞凋亡同時(shí)進(jìn)行并形成動(dòng)態(tài)平衡，一旦這種平衡被打破，將導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)，疾病隨之而來(lái)。目前研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡至少受三種通路調(diào)控，分別為：線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明細(xì)胞凋亡在腰椎間盤退變過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，主要表現(xiàn)為椎間盤內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞密度降低，使得細(xì)胞外基質(zhì)的生成減少，打破了椎間盤基質(zhì)生成與破壞的動(dòng)態(tài)平衡，最終導(dǎo)致椎間盤退變。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種凋亡相關(guān)因子可參與到椎間盤細(xì)胞凋亡途徑之中。據(jù)報(bào)道[2]，凋亡促進(jìn)因子Fas/FasL可通過(guò)線粒體通路及死亡受體通路誘導(dǎo)并加速椎間盤細(xì)胞凋亡。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，隨著椎間盤退變過(guò)程中的階段不同，凋亡途徑也有所不同：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路主要參與在椎間盤輕度退變節(jié)段，死亡受體通路主要參與椎間盤中度退變階段，線粒體通路在椎間盤中、重度退變階段較為重要[2]。

Caspase家族作為細(xì)胞凋亡通路中最重要的調(diào)控因子，主要分為三類：凋亡執(zhí)行因子、凋亡起始因子及炎癥介導(dǎo)因子。其中caspase-9作為重要的凋亡啟動(dòng)因子，其全長(zhǎng)1 924 bp，含有9個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子，可編碼435個(gè)氨基酸，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，與細(xì)胞色素C(CytC)和相關(guān)激活因子結(jié)合后使得自身活化，后激活下游的caspase家族中凋亡執(zhí)行因子，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使染色體降解、凋亡小體形成從而引起凋亡[3]。而caspase-3就是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最重要的凋亡執(zhí)行因子，該因子以酶原的形式存在，主要分布于胞漿，并不具有生物學(xué)功能，只有被上游凋亡啟動(dòng)因子(如caspase-9)激活后才可裂解為活性小體，再重新結(jié)合相關(guān)蛋白酶而發(fā)揮凋亡作用[3]。

本研究結(jié)果顯示：腰椎間盤退行性病變患者血清caspase-3，9濃度明顯高于正常健康者，且血清caspase-3，9濃度與腰椎間盤突出節(jié)段的數(shù)量呈正比，說(shuō)明了凋亡因子caspase-3，9參與了腰椎間盤退變的發(fā)生或發(fā)展。近年來(lái)多種基因敲除動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)顯示，抑制caspase-3的表達(dá)可顯著阻滯體內(nèi)和體外的細(xì)胞凋亡[4]。臨床上或許可以利用caspase-3，9為靶點(diǎn)抑制椎間盤細(xì)胞凋亡，通過(guò)靶向治療延緩椎間盤退變過(guò)程，讓那些具有椎間盤手術(shù)潛在風(fēng)險(xiǎn)的患者免于手術(shù)的苦痛，從根本上預(yù)防腰椎間盤退行性病變及腰椎間盤突出癥。

綜上所述，凋亡促進(jìn)因子caspase-3，9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在腰椎間盤退變過(guò)程中起著重要的作用，是腰椎間盤突出癥的病因機(jī)制，今后進(jìn)一步的研究應(yīng)以caspase-3，9為靶點(diǎn)抑制椎間盤細(xì)胞凋亡，同時(shí)篩選并建立出更完整的椎間盤相關(guān)細(xì)胞凋亡因子表達(dá)譜，對(duì)腰椎間盤退行性病變及腰椎間盤突出癥進(jìn)行靶向免疫治療必將成為可能。

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