李騰達，龍曙萍，黃元蘭，劉　鵬，張薇薇，郭　杰，劉　云，谷明莉，鄧安梅

(1.第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院，上?！?00433；2.解放軍455醫(yī)院，上海　200052)

自身免疫性胰腺炎(autoimmune pancreatitis，AIP)是一種新的胰腺疾病類型，被分為1型與2型，由于其生物學檢測的低靈敏性及標志物的非特異性，使AIP的早期診斷及鑒別診斷成為難點[1]。目前關于AIP的病理機制研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞是參與病理過程的重要細胞：Th2型細胞因子IL-4和Treg分泌的調(diào)節(jié)性細胞因子IL-10，TGF-β在病人病理組織中上調(diào)，參與了疾病形成過程[2]；Th1型細胞及其細胞因子IFN-γ在外周血中上升，影響了疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。

外泌體(exosomes)是一種穩(wěn)定的細胞外囊泡，大小為50～150 nm，表面有豐富的蛋白CD63，CD9和CD81，包含了細胞內(nèi)全面的生物信息，被視為母細胞的“指紋印跡”[4]。目前有研究報道外泌體可能與急性胰腺炎相關的肺部損傷[5]、胰腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關[6]，但外泌體在AIP中的研究尚未進行。CD69是一種T細胞激活早期表達的表面分子，其在CD4+T細胞中表達[7]，與自身免疫性疾病如自免性糖尿病、自免性肝炎等密切相關[8，9]，研究表明在AIP的小鼠模型MRL/MpJ中，CD4+/CD69+Th細胞與疾病嚴重程度相關，CD69可能通過影響CD4+T細胞參與了AIP的致病過程[10]?；诖耍緦嶒灁M比較CD69在AIP病人和健康人血清外泌體中的表達量，并進一步探討其與CD4+T細胞所分泌的細胞因子的相關性，旨在為AIP疾病提供新的診治靶點和思路。

1　材料和方法

1.1研究對象收集2012年10月～2016年12月來第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院就診的35例AIP病人血清作為實驗組，收集同期就診的35例健康個體血清作為對照組，所有血清凍存于-80℃待用。AIP診斷標準參見國際胰腺疾病學會關于自身免疫性胰腺炎的國際統(tǒng)一診斷標準指南，實驗組年齡為66.36±7.78歲，男女比例為19∶6。健康對照組年齡為64.24±8.67歲，男女比例為3∶1。兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究經(jīng)第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院醫(yī)學科研倫理委員會批準，所有受試對象均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)，酶標儀(Thermo Scientific公司)，生物分光光度計(德國Eppendorf公司)，離心機(美國Beckman)，流式細胞儀(美國Beckman)，透射電鏡(日本電子)，抗體(美國Abcam公司)，磁珠(上海秉宏生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1血清收集：采集無抗凝劑全血后在1～2 h內(nèi)進行分離，離心條件為2 500 g×10 min，或室溫擱置待血清形成直接收集。所有樣本裝EP管，-80℃長期保存。

1.3.2血清外泌體的分離：將血清于冰上溶解，取200 μl，加入10 ml左右PBS稀釋后經(jīng)0.2 μm過濾器過濾，按照下列程序進行超高速離心：2 000 g，10 min，去除沉渣，140 000 g，4℃，3 h，保留沉淀，PBS洗滌沉淀并重懸，再次離心140 000 g，4℃，3 h，得到的沉淀用200 μl PBS重懸。取10 μl外泌體溶液滴入300目銅碳網(wǎng)上，干燥后進行電鏡下形態(tài)學觀察。

1.3.2磁珠結(jié)合流式進行外泌體表面抗原的鑒定：取200 μl磁珠用500 μl MEST溶液洗2次后，用200 μl 5 mg/ml EDC和NHS溶液進行活化，37℃，30 min。加入約10 μl抗體，37℃，搖3 h。磁性分離移除上清，加1 ml PBST重懸，37℃，溫育30 min后，用PBST洗3次。加入約100 μl外泌體溶液，37℃搖1 h，移除上清，PBS洗3次。各管加入1 ml 30 μmol/L的Dio染料，37℃，30 min，磁性分離移除上清，用無水乙醇洗3次，PBS重懸，待測。

1.3.3ELISA法檢測血清中細胞因子的表達水平：按照ELISA試劑盒操作說明進行相關因子的檢測。

1.4統(tǒng)計學分析兩組間計量資料的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α為0.05，相關性分析以Pearson相關系數(shù)表示，統(tǒng)計軟件為SPSS21.0與GraphPad Prism 6.0。

2　結(jié)果

2.1實驗組與對照組血清中外泌體表面分子的流式分析見表1。CD9，CD63，CD81在實驗組與對照組分離出的外泌體中均有表達，實驗組高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與CD9，CD63，CD81等非特異性分子相比，CD69在實驗組外泌體中明顯增高，約為對照組的5倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)。

細胞因子實驗組對照組tPCD69CD9CD63CD8185.76±19.4555.87±12.9866.98±13.5457.45±15.7617.01±5.8948.89±10.7854.23±16.2346.11±16.3420.012.4473.5692.955<0.00010.01700.00070.0043

2.2實驗組與對照組血清中細胞因子的表達水平見表2。與對照組相比，實驗組血清中IL-4，IFN-γ，TGF-β增高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IL-10在兩組之間的表達無統(tǒng)計學差異。

細胞因子實驗組對照組tPIL-4(ng/ml)IFN-γ(ng/ml)IL-10(pg/ml)TGF-β(pg/ml)0.84±0.236.89±1.67509.78±167.45365.76±154.980.25±0.060.84±0.22456.89±170.34168.87±43.8714.6821.251.3107.232<0.0001<0.00010.1946<0.0001

2.3實驗組外泌體CD69的表達情況與血清細胞因子的相關性分析見表3。實驗組CD69+外泌體與IL-4，IFN-γ，TGF-β呈正比(P<0.05)，CD69-外泌體與IL-4，IFN-γ，IL-10，TGF-β呈反比(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。

表3實驗組外泌體CD69的表達情況與血清細胞因子的相關性分析

細胞因子CD69+exosome%rP D69-exosome%rPIL-4IFN-γIL-10TGF-β0.4650.6780.1020.548<0.005<0.001>0.05<0.001 -0.589-0.399-0.784-0.657<0.001<0.05<0.001<0.001

注：r0.05/2，33=0.334，r0.01/2，33=0.430，r0.005/2，33=0.464，r0.001/2，33=0.532。

3討論AIP是一種新型胰腺疾病，其免疫病理形成機制目前尚不明晰，專家認為CD4+T細胞，可從Th0細胞分化為Th1/Th2及Treg細胞等[11]，是參與AIP病理過程的重要細胞：Th2型免疫反應可能參與了AIP疾病的進展，Th1型反應與疾病早期發(fā)展相關，而Treg分泌的IL-10與TGF-β可調(diào)節(jié)IgG4和纖維化過程，同時影響了Th1，Th2細胞分化[3]。但值得注意的是對AIP疾病機理認識的不完整性以及其生物學標志物的非特異性非靈敏性，使得該病存在早診困難等問題。

外泌體是一種穩(wěn)定的細胞外囊泡，通過胞內(nèi)囊泡的內(nèi)吞途徑形成，包含了細胞內(nèi)蛋白、mRNA，非編碼RNA及DNA等生物分子，在人體外周大量存在，相當于其來源細胞的“指紋”[4]。外泌體表面具有鑒定意義的標志物有CD9，CD63，CD81等，不同細胞來源其表面抗原的表達情況有所不同[4]。研究表明胰腺癌細胞來源的外泌體相比較于正常對照組，表面有豐富的GPC-1等標志物，能夠?qū)⒃缙谝认侔┳兣c胰腺良性病變區(qū)別開來[12]，但值得注意的是AIP來源的外泌體尚未被研究。

CD69也叫做早期激活抗原(EA-1)和激活誘導分子(AIM)，一旦T細胞被激活就會表達于其表面。研究表明，CD69在T細胞的表達與Th1型細胞因子IFN-γ相關；在Treg細胞中，僅有表達CD69的Treg能夠分泌高水平的TGF-β[7]。在自身免疫性疾病如自身免疫性糖尿病中CD69和疾病嚴重程度相關[8]，自身免疫性肝炎中CD4+CD25-CD69+T細胞擴增的抑制可改善疾病[9]，說明CD69在自身免疫性疾病中有重要作用，且可能與CD4+T細胞相關。近來有研究表明，在AIP的小鼠模型MRL/MpJ中，CD4+/CD69+Th細胞亦與疾病呈正相關，說明CD69在AIP中亦有重要作用，可能通過CD4+T細胞影響疾病進程[10]?；贑D69在自身免疫性疾病中的重要性，外泌體的疾病特異性，與AIP疾病監(jiān)測的不完善性，本課題對AIP中CD69+的外泌體進行了檢測以完善AIP的診治手段，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)CD69+外泌體在AIP病人中明顯增高，并與IL-4，IFN-γ，TGF-β呈正比，說明CD69+外泌體可能與CD4+T細胞功能相關，進而參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，但本文標本較少，尚需進一步擴大樣本量，并進行更進一步免疫學探究。

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