孫海柏，張麗霞，劉佳慶，郭明日，李玉明，馮冉冉，劉雅，謝怡

（天津市海河醫(yī)院，天津 300350）

結(jié)核性胸膜炎是由結(jié)核菌及其代謝物進入正處于高度過敏狀態(tài)的機體胸膜腔引起的胸膜炎癥，由于治療不及時或不規(guī)范形成慢性包裹性積液、結(jié)核性膿胸及支氣管漏等并發(fā)癥，嚴重影響了患者的呼吸功能，甚至可導致死亡[1]。目前診斷方法中抗酸染色陽性率極低，僅為0%～25%，胸腔積液及胸膜活檢標本培養(yǎng)陽性率低，且培養(yǎng)時間耗時過長，難以及時指導臨床治療，診斷金標準的胸膜活檢陽性率不高。選擇快速準確的診斷結(jié)核性胸膜炎的方法尤為重要。

1　資料與方法

1.1　一般資料

選取2012年6月-2016年10月于天津市海河醫(yī)院就診的結(jié)核性胸膜炎患者101例作為結(jié)核性胸膜炎組，其中男性75例，女性26例；年齡17～83，平均42.3歲。納入標準：①患者有相應的臨床表現(xiàn)，如發(fā)熱、盜汗、疲乏、胸痛、刺激性干咳及結(jié)核中毒等癥狀；②超聲提示有不同程度的胸腔積液，且胸部CT伴有或不伴有結(jié)核病灶；③胸腔積液為滲出液，其中淋巴細胞增多，所占比例50%；腺苷酸脫氨酶（adenylate deaminase，ADA）≥40 IU/L，抗結(jié)核抗體陽性；④胸腔積液涂片或培養(yǎng)結(jié)核桿菌陽性；⑤結(jié)核菌素純蛋白衍生物皮試試驗陽性或強陽性；⑥胸膜活檢有典型結(jié)核病變（如結(jié)核性肉芽腫或干酪樣病變）；⑦常規(guī)治療無效，經(jīng)抗結(jié)核治療2～4周好轉(zhuǎn)，最終確診。選取同期院內(nèi)其他疾病合并胸腔積液的患者79例作為對照組。其中，男性49例，女性30例；年齡21～78歲，平均43.5歲?；颊哂写笕~性肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重期、支氣管肺癌、胸膜轉(zhuǎn)移癌、惡性胸膜間皮瘤及惡性淋巴瘤等疾病，均無肺結(jié)核及肺外結(jié)核病史。納入標準：①胸腔積液為滲出液，普通細菌培養(yǎng)陰性；②胸膜病理學檢查排除結(jié)核；③無結(jié)核中毒癥狀；④臨床上可明確胸水為原發(fā)性疾病所致。

1.2　方法

1.2.1標本采集兩組在初診時抽取胸水留取70 ml分裝到4個5 ml無菌管和1個50 ml無菌容器內(nèi)，第1管進行細菌學鑒定，第2管進行生化免疫實驗，第3管用于利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測（Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF），第4管用于常規(guī)檢測，50 ml無菌容器用于結(jié)核感染T細胞斑點檢測（detection of T cell spot in tuberculosis，T-SPOT.TB）。

1.2.2實驗方法①結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）檢測。BACTEC MGIT960培養(yǎng)及耐藥性，按照結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程進行操作。②Xpert MTB/RIF檢測。取1 ml胸水標本加入前處理管中，視樣本性狀加入2倍樣本體積的標本處理液，渦旋振蕩15～30 s靜置15 min，吸取2 ml處理后樣本緩慢加入反應盒，放入檢測模塊進行自動化檢測。MTB結(jié)果判讀根據(jù)DNA拷貝的高低分為高、中、低、極低及未檢測出5個等級；利福平藥敏結(jié)果分為：耐藥、未檢出及敏感。③T-SPOT.TB檢測。采用淋巴細胞分層液經(jīng)密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，計數(shù)并分別定量至2.5×106/ml。分離胸水單個核細胞（pleural effusion mononuclear ce11，PEMC），計數(shù)并分別定量至 2.5×106/ml、2.5×105/ml、2.5×104/ml及2.5×103/ml的細胞懸液（留取3例結(jié)核性胸膜炎及3例對照組所致胸腔積液進行小樣本預試驗，從而確定大樣本實驗的最佳PEMC濃度）。然后操作步驟完全按照說明書要求進行操作。

1.2.3儀器與試劑PLR-線性探針雜交酶顯色法診斷試劑盒（德國Hain Lifescience公司），Hotstar Taq酶（德國Qiagen公司），MGIT960液體培養(yǎng)基及藥敏管（美國BD公司），Hain GT Blot-48全自動雜交儀（德國Hain Lifescience公司），PCR儀（德國Hain Lifescience公司），Eppen-dorf 5804R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），生物安全柜（青島海爾公司），結(jié)核感染T細胞檢測試劑盒（上海復星公司），GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)（美國Cepheid公司）。

1.3　統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用t檢驗，計數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　兩組患者一般資料比較

兩組患者葡萄糖、腺苷酸脫氨酶（adenylate deaminase，ADA）、抗結(jié)核抗體（anti tuberculosis antibody，TB-Ab）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩組患者男女比例、年齡、唾液酸（sialic acid，SA）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、α-羥丁酸脫氫酶（alpha-hydroxybutyric dehydrogenase，HBDH）及白細胞比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2　結(jié)核性胸膜炎組患者Xpert MTB/RIF和T-SPOT.TB檢測結(jié)果分析

Xpert MTB/RIF和T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性分別為82.18%（95%CI：0.78，0.85）和88.12%（95%CI：0.84，0.91），兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.591，P=0.018），特異性分別為96.10%（95%CI：0.94，0.98）和 98.73%（95%CI：0.97，0.99），兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3　3種檢測方法對斷結(jié)核性胸膜炎的結(jié)果分析

以MGIT 960液體培養(yǎng)為標準，Xpert MTB/RIF的陽性率為79.57%，兩種方法的Kappa值為0.277，一致性較低。以MGIT960檢測為標準，T-SPOT.TB檢測的陽性率為94.62%，兩種方法的Kappa值為0.668，一致性較高。

工作隊駐村之后，立刻在第一書記王從愿的帶領(lǐng)下，攜手曼來村“三委”成員，分組入戶，給村民們建檔建案建數(shù)據(jù)，深入了解具體情況。在精準分析和論證各家的貧困原因及貧困類型后，工作隊定下了“攻心”“攻新”的扶貧脫貧戰(zhàn)略。

2.4　2種檢測方法藥敏檢測結(jié)果分析

101例結(jié)核性胸膜炎的胸腔積液標本以藥物敏感試驗檢測結(jié)果為金標準，采用Xpert MTB/RIF檢測101例菌株的利福平耐藥性。其中25例未檢測出來，2例為陰性，76例標本分別采用BACTEC MU1T960及Xpert MTB/RIF進行檢測，其中70例均耐藥，4例均敏感，兩種方法的kappa值為0.786，具有極好的一致性。

2.5　耐藥基因突變位點分析及構(gòu)成比

對利福平耐藥陽性的6份標本進行基因突變位點分析。見表2。

表1　兩組患者一般資料比較

表2　耐藥基因突變位點分析及構(gòu)成比

3　結(jié)論

T-SPOT.TB是近年來發(fā)展起來的一項快速診斷結(jié)核病的新技術(shù)，其原理是指當人體T細胞受到結(jié)核菌抗原的再次刺激后，活化的效應T細胞，產(chǎn)生抗結(jié)核感染免疫中的關(guān)鍵性細胞因子干擾素-γ[2]。此技術(shù)已經(jīng)很成熟的應用于臨床實驗室檢測，具有較高的敏感度和特異性，且與卡介苗不存在交叉反應的優(yōu)勢引起臨床越來越多的重視[3]。對于患者全血的研究較多，但對于胸腔積液中干擾素的釋放研究較少，本文收集患者的胸腔積液提取單個核細胞進行檢測，以提高診斷的準確率，診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏性和特異性為96.10%和98.73%，均較高。LEE等[4]對歐洲及我國臺灣地區(qū)的胸腔積液進行了小樣本研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胸水及外周血的T-SPOT.TB檢測診斷結(jié)核性胸膜炎均有較好的敏感性、特異性，還有報道結(jié)核性胸膜炎有較高的陽性率達91.67%，報告結(jié)論與本文的實驗結(jié)果相接近，并且在一些研究中也證實了T-SPOT.TB檢測在肺外不同部位結(jié)核中的診斷價值[5]。有文獻報道T-SPOT.TB檢測聯(lián)合ADA檢測也可提高檢測的準確率[6]。Xpert MTB/RIF是檢測結(jié)核分枝桿菌及其對利福平耐藥性的快速分子診斷方法，目前肺外結(jié)核運用較多，但是對胸腔積液的診斷中以金標準為標準其敏感性較低，當胸水中結(jié)核分枝桿菌太少或標本中含Taqman抑制物及分枝桿菌DNA提取效率低時，都有可能出現(xiàn)假陰性[7]。一些文獻中報道結(jié)核性胸膜炎Xpert MTB/RIF敏感性和特異性分別為28.7%和96.6%，而相應的陽性和陰性預測值分別為96.1%和31.1%[8]。此外，近來應用Xpert MTB/RIF檢測胸膜組織樣本發(fā)現(xiàn)，Xpert MTB/RIF未能檢測出任何已確診的結(jié)核患者[9]。結(jié)合本文所做測試結(jié)果，Xpert MTB/RIF對胸腔積液靈敏度較低（15%～44%），準確度有限。胸腔積液Xpert MTB/RIF試驗不能準確診斷胸膜結(jié)核，不推薦用作疑似胸膜結(jié)核患者的初始評價試驗[10]。還有些報道認為Xpert MTB/RIF在非呼吸道標本中診斷結(jié)核病的敏感度不一致，但特異性均較高[11-12]。

Xpert MTB/RIF系統(tǒng)是用于檢測結(jié)核病的分子診斷平臺，由于大多數(shù)利福平耐藥菌株都對異煙脅耐藥，因此利福平耐藥情況在一定程度上能作為耐多藥結(jié)核病的檢測指標[13]。其以通過rpoB基因RIF的耐藥決定區(qū)的81 bp核心區(qū)為靶序列，能夠在2 h內(nèi)檢測MTB和利福平的耐藥性[14]。Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性與MGIT960不一致的情況，可能是由于rpoB區(qū)內(nèi)其他突變所致或者由于其他基因突變導致，理論上標本中含有≥1種的MTB混合培養(yǎng)或污染時，若其中一種有突變探針未涵蓋的突變，將出現(xiàn)野生型帶型[15]。本次實驗對Xpert MTB/RIF與金標準對胸水的檢測進行比較，結(jié)果一致性較好，但是標本量較少，有待于進一步研究，同時也值得臨床進一步推廣。

綜上所述，T-SPOT.TB對結(jié)核性胸水診斷的敏感性及特異性，同時結(jié)合Xpert MTB/RIF的特異性能對結(jié)核性胸膜炎作出快速診斷和排除。Xpert MTB/RIF可直接檢測MTB的核酸并可檢出其對利福平的耐藥性，使病人得到快速診治。

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