杜發(fā)旺，劉紅梅，何正光，杜先智，羅曉斌

（1.四川省遂寧市中心醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，四川 遂寧 629000；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，重慶 400010）

糖尿病患者血清轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）濃度高于健康人群[1-2]。TGF-β1能抑制免疫細胞的增殖與分化，介導炎癥反應與機體免疫應答，但作用機制仍不明確[1-3]；γδT細胞除直接殺死病原菌外，還能分泌多種淋巴因子，在機體的細胞免疫、體液免疫中發(fā)揮重要作用[4-5]。為探討TGF-β1對γδT細胞功能的影響，本研究采脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）作用于γδT細胞，加入TGF-β1干預，檢測γδT細胞分泌淋巴因子干擾素γ（Interferons-γ，IFN-γ）、白細胞介素2（Interleukin 2，IL-2）的變化，觀察TGF-β1對γδT細胞Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR-4）表達的影響，從細胞信號通路的角度探討TGF-β1抑制細胞炎癥反應的可能機制。

1　材料與方法

1.1　材料

RPMI 1640干粉劑（美國Gibco公司），胎牛血清、LPS、TGF-β1、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自美國Sigma公司，RNA提取、cDNA制取、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）等相關(guān)試劑購自日本TaKaRa公司，PCR引物（大連寶生生物工程有限公司），Western blot檢測相關(guān)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），淋巴細胞分離（中國生命科學研究院），Anti-human γδTTCR–FITC、陰性空白對照試劑Mouse IgG1 K Isotype Control購自美國eBioscience公司，TLR-4抗體（美國Abcom公司）。

1.2　方法

1.2.1γδT細胞的獲取取健康志愿者外周血100 ml，使用肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離出單個核細胞[3]，將所得的外周血單個核細胞細胞用PBS調(diào)整細胞濃度至1×108個/ml，加入Antihuman γδT-TCR–FITC抗體標記的γδT細胞，恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min后離心，以Mouse IgG1 K Isotype Control為陰性空白對照，使用流式細胞儀分離、純化γδT細胞。

1.2.2不同濃度的TGF-β1刺激γδT細胞將分離純化的γδT細胞培養(yǎng)于6孔板中，每組設置3個復孔，重復3次。在6孔板中分別加入不同濃度的TGF-β1，使TGF-β1終濃度分別為0、5、10、20和50 mmol/L。在每孔中加入濃度為300 pg/ml的唑來膦酸，并將6孔板置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，換細胞培養(yǎng)液1次/2 d。第12天，采用ELISA法檢測上清培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-2的含量，并用Western blot和PCR檢測TLR-4的蛋白表達及基因轉(zhuǎn)錄。

1.2.3LPS、TGF-β1刺激γδT細胞將分離純化的γδT細胞培養(yǎng)于6孔板中，每組設置3個復孔，重復3次，分4組培養(yǎng)：①空白對照組；②LPS組（LPS 100 ng/ml）； ③ LPS+TGF-β1組（LPS 100 ng/ml+TGF-β120 mmol/L）； ④ TGF-β1組（TGF-β120 mmol/L）。并在每孔中加入濃度為300 pg/ml的唑來膦酸，并將6孔板置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，換細胞培養(yǎng)液1次/2 d。第12天，采用ELISA法檢測上清培養(yǎng)液中IL-2、IFN-γ的含量，并用Western blot和PCR檢測TLR-4的蛋白表達及基因轉(zhuǎn)錄。

1.2.4RT-PCRRT-PCR檢測TLR-4的轉(zhuǎn)錄。將γδT細胞按1.2.2、1.2.3中的實驗步驟培養(yǎng)12 d后，參照說明書步驟提取總RNA、制取cDNA、配制PCR反應液及Real time反應體系，設置好擴增條件，最后繪制出熔解曲線（每組實驗重復3次）。TLR-4正向引物：5’-CCTGTCCCTGAACCCTATGA-3’，反向引物：5’-TCTAAACCAGCCAGACCTTGA-3’；內(nèi)參 GAPDH正向引物：5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAACC-3’，反向引物 ：5’-CATGAGTCCTTCCACGATACC-3’。

1.2.5Western blot檢測Western blot檢測TLR-4蛋白的變化。將γδT細胞按照1.2.2、1.2.3中的實驗步驟培養(yǎng)12 d后，參照說明書提取總蛋白、檢測蛋白濃度，并調(diào)整好濃度（4μg/μl），在沸水中加熱5 min。進行SDS-PAGE電泳（加入蛋白樣品15μl/孔），用5%脫脂奶粉封閉1 h，再加入按照稀釋一抗（1∶1 200）或內(nèi)參（1∶3 000），4℃恒溫冰箱封閉12 h，次日再次洗膜3次，加入5%脫稀釋加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），37℃孵育1 h，再次洗滌后顯影成像，并用Quantity One軟件分析各條帶灰度值，每組實驗重復3次。

1.2.6ELISA法收集TGF-β1、LPS處理的各實驗組上清液，按照ELISA雙抗體夾心法試劑盒說明書測定上清液中IL-2、IFN-γ的濃度。

1.3　統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用方差分析，方差分析的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　γδT細胞的純度

從外周血PBMC中用流式細胞儀分離出的γδT細胞，其純度可達92.54%，該純度可以滿足γδT細胞的功能研究。圖1A為同型陰性對照，圖1B為γδT細胞在外周血中占的比例（6.25%）。見圖1。

2.2　γδT細胞TLR-4 mRNA的表達

不同濃度TGF-β1組TLR-4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.826，P=0.018），TGF-β1對 γδT細 胞 的TLR-4基 因轉(zhuǎn)錄有抑制作用，且隨TGF-β1濃度增加，TLR-4 mRNA的表達呈梯度下降；20和50 mmol/L TGF-β1組與0 mmol/L TGF-β1組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

分組培養(yǎng)后，各實驗組TLR-4基因轉(zhuǎn)錄水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.191，P=0.035），進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，LPS組TLR-4基因轉(zhuǎn)錄水平與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；LPS+TGF-β1組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但較LPS組TLR-4基因轉(zhuǎn)錄水平下降（P＜0.05）。見圖3。

2.3　γδT細胞TLR-4蛋白的表達

不同濃度TGF-β1組 TLR-4蛋白的表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.312，P=0.023），TGF-β1對γδT細胞TLR-4蛋白的表達有抑制作用，且隨TGF-β1濃度增加，TLR-4蛋白的表達水平呈梯度下降；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，20和50 mmol/L TGF-β1組與0 mmol/L TGF-β1組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

分組培養(yǎng)后，各實驗組TLR-4蛋白的表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.215，P=0.016），進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，LPS組TLR-4蛋白表達較空白對照組升高（t=4.893，P=0.008），TGF-β1組TLR-4蛋白表達較空白對照組降低（P＜0.05），LPS+TGF-β1組 TLR-4蛋白表達較空白對照組升高（P＜0.05），但較LPS組TLR-4蛋白表達水平下降（P＜0.05）。見圖5。

2.4　IFN-γ水平比較

不同濃度TGF-β1組的IFN-γ水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=11.298，P=0.033），TGF-β1抑制IFN-γ的表達，且隨TGF-β1濃度增加，IFN-γ水平越低；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，20和50 mmol/L TGF-β1組與0 mmol/L TGF-β1組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖6。

分組培養(yǎng)后，各實驗組的IFN-γ水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=11.319，P=0.039），進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，LPS組的IFN-γ表達較空白對照組增加（P＜0.05），TGF-β1組的IFN-γ表達較空白對照組降低（P＜0.05），LPS+TGF-β1組的IFN-γ表達較空白對照組增加（P＜0.05），但較LPS組的IFN-γ表達水平下降（P＜0.05）。見圖7。

圖1　γδT細胞的純度

圖2　不同濃度TGF-β1對γδT細胞TLR-4 mRNA表達的影響?。ā纒）

圖3　各實驗組TLR-4基因轉(zhuǎn)錄水平比較?。ā纒）

圖4　不同濃度TGF-β1對γδT細胞TLR-4蛋白表達的影響

圖5　各實驗組TLR-4蛋白的表達

圖6　不同濃度TGF-β1對IFN-γ水平的影響?。ā纒）

2.5　IL-2水平比較

不同濃度TGF-β1組的IL-2水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.817，P=0.025），TGF-β1抑制IL-2的表達，且隨TGF-β1濃度增加，IL-2水平越低；進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，20和50 mmol/L TGF-β1組與0 mmol/L TGF-β1組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖8。

分組培養(yǎng)后，各實驗組的IL-2水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=7.948，P=0.012），進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，LPS組IL-2的表達較空白對照組增加（P＜0.05），TGF-β1組的IL-2表達較空白對照組降低（P＜0.05），LPS+TGF-β1組的IL-2表達較空白對照組增加（P＜0.05），但較LPS組的IFN-γ表達水平下降（P＜0.05）。見圖9。

圖7　各實驗組IFN-γ水平比較?。ā纒）

圖8　不同濃度TGF-β1對IL-2水平的影響　（±s）

圖9　各實驗組IL-2水平比較?。ā纒）

3　討論

γδT細胞屬于CD4-、CD8-雙陰性細胞，抗原的提呈及激活不受MHC限制，作用介于固有免疫與適應性免疫之間，識別抗原后，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導機制，活化及促進炎癥因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-17等的分泌[4-6]，直接或間接參與機體細胞免疫及體液免疫，在抗感染早期及啟動機體免疫應答過程中發(fā)揮重要作用。

IFN-γ、IL-2是炎癥反應及免疫反應過程中的重要因子，IFN-γ具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠激活及增強機體免疫細胞，并介導相關(guān)抗炎機制，增強對病原微生物及感染細胞的殺傷作用[5-6]，國內(nèi)外大量研究顯示，γδT細胞是機體早期產(chǎn)生IFN-γ最主要的細胞，同時也能分泌較多的IL-2，IL-2具有多種生物功能，最引人關(guān)注的是能激活T細胞，并維持T細胞的活化及增殖，調(diào)節(jié)機體免疫應答，促進抗體產(chǎn)生，參與炎癥反應及殺滅病原微生物[7]，本研究ELISA結(jié)果顯示，加入LPS后，IFN-γ、IL-2水平升高，得出相似的結(jié)論。

TGF-β1屬于多功能的生長調(diào)節(jié)因子，能調(diào)節(jié)免疫細胞的增殖與分化、介導炎癥反應與機體免疫應答，改變機體的免疫能力[8-9]，近年來研究表明，TGF-β1能抑制TLR-4受體信號傳導途徑及誘導免疫細胞凋亡[10-11]，但是其具體的作用機制仍需進一步探討。Toll樣受體是一類天然免疫受體，能識別某些病原體或者其產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，然后啟動炎癥信號通路，促進炎癥介質(zhì)的釋放，激活免疫系統(tǒng)。TLR-4主要識別革蘭陰性菌LPS，激活免疫系統(tǒng)相關(guān)跨膜通道，釋放大量的IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-17等炎癥因子[12-13]。本研究使用LPS刺激γδT細胞后，TLR-4的轉(zhuǎn)錄及表達增強，且γδT細胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2的能力提高。加入TGF-β1后，IFN-γ、IL-2水平較LPS組下降，同時TLR-4在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平下降，這提示TGF-β1能夠下調(diào)LPS對γδT細胞的刺激作用。同時觀察到，γδT細胞總數(shù)下降，并且γδT細胞的增殖向Vδ1γδT細胞偏倚，提示TGF-β1可能通過某種機制抑制γδT細胞的增殖及改變γδT細胞的亞群，對γδT細胞起負性調(diào)節(jié)作用，同時也在一定程度上解釋了糖尿病患者免疫低下、易感的機制，可能與免疫細胞增殖抑制、細胞亞群改變、抗炎因子減少等有關(guān)。本實驗還發(fā)現(xiàn)，盡管LPS+TGF-β1組γδT細胞分泌產(chǎn)生的IFN-γ、IL-2及TLR-4轉(zhuǎn)錄、表達水平較LPS組下降，但是仍較空白對照組增加，提示LPS對γδT細胞的刺激作用除與TLR-4途徑密切相關(guān)外，還可能通過其他途徑對γδT細胞起刺激促進作用，需進一步研究。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能減弱γδT細胞分泌IFN-γ、IL-2等淋巴因子，并減少γδT細胞TLR-4蛋白的轉(zhuǎn)錄及表達，下調(diào)LPS對γδT細胞的刺激促進作用，并改變γδT細胞的增殖及分化，這從一定程度解釋了炎癥反應、細胞免疫與細胞信號通路的關(guān)系，有助于對病原微生物的免疫逃避、機體免疫調(diào)控的理解，也從一方面解釋了糖尿病患者易感染的可能機制，但其具體的抑制分子機制仍不明確，需進一步研究。

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