張瑩，李惠瓊，鄒佳，王滔，李玲玲，申慧芳，岳續(xù)朋，崔國禎

（1.遵義醫(yī)學(xué)院 珠海校區(qū)生物工程系（廣東省珠海市中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），廣東 珠海 519041；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 珠海 519015）

心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，其死亡率居我國各種疾病之首[1]。有研究表明，飲用綠茶可以顯著降低心血管疾病的死亡率[2]，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以蛋白酶ERp57為抗血小板聚集藥物的作用靶點(diǎn)，采用虛擬篩選與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，對(duì)鳳岡富鋅硒茶預(yù)防心血管疾病的作用靶點(diǎn)和有效成分進(jìn)行探討，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)綠茶抗心血管疾病的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

鳳岡富鋅硒茶由貴州省鳳岡縣萬壺緣鋅硒茶業(yè)有限公司提供，乙腈、甲酸、甲醇（色譜純）購自德國Merck公司，分析標(biāo)準(zhǔn)品表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）（純度≥98%）、氯吡格雷購自上海阿拉丁試劑公司，分析標(biāo)準(zhǔn)品表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）和咖啡因（Caffeine，CAF）（純度≥98%）購自寶雞金泰區(qū)辰光生物公司，胰島素溶液（美國Sigma公司），ERp57蛋白酶（本實(shí)驗(yàn)室自制），新西蘭兔[廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2014-0035]，枸櫞酸鈉采血管（冀州市博昌醫(yī)療器械有限公司），二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）（美國 Sigma公司）。

1.2　儀器與設(shè)備

超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）[美 國 Waters公 司， 配 有Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50.0 mm，1.7μm）色譜柱、二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站]，冷凍干燥機(jī)（ALPHA2-4/LSC PLUS型）（德國CHIRST公司），Multiskan Mk3酶標(biāo)儀（美國寶特公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司），血小板聚集儀（美國Helena公司），臺(tái)式低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙赫西儀器裝備有限公司）。

1.3　方法

1.3.1鳳岡富鋅硒茶的提取取鳳岡富鋅硒茶置于80℃烘箱烘干，打粉機(jī)粉碎后取200 g茶粉，加入2 L沸騰的雙蒸水中，煎煮10 min，紗布過濾并收集濾液。濾渣再加入2 L沸騰的雙蒸水中，重復(fù)上述步驟2次。3次濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥儀干燥后稱重，得到綠茶水提取物。

1.3.2UPLC檢測(cè)綠茶水提取物①供試品溶液的制備。精確稱取綠茶水提取物0.2 g，加入10 ml 50%甲醇溶液于試管中，超聲5 min，用注射器吸取2 ml，0.22μm濾膜過濾，得到待測(cè)液。②標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制。精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品EGCG、EGC、ECG和CAF各2 mg，加入5 ml 50%甲醇溶液于試管中，超聲5 min，用0.22μm濾膜過濾，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液。③UPLC色譜條件。UPLC儀，流動(dòng)相A：45 ml乙腈、10 ml甲酸，以去離子水定容至500 ml；流動(dòng)相B：400 ml乙腈、10 ml甲酸，以去離子水定容至500 ml。色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×50.0 mm，1.7μm）。梯度洗脫條件：0～ 10 min（100% A），10～32 min（100%～80% A）。流量1.0 ml/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；進(jìn)樣量10μl。

1.3.3ERp57蛋白酶活性測(cè)定采用胰島素渾濁度分析方法檢測(cè)綠茶水提取物及其化合物對(duì)ERp57蛋白酶活性的抑制作用[3-4]。將反應(yīng)體物[胰島素、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、ERp57蛋白酶和待測(cè)樣品]加入到96孔板中反應(yīng)振蕩30 s，檢測(cè)630 nm波長(zhǎng)處的吸光度，讀數(shù)1次/4 min，持續(xù)檢測(cè)68 min，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。酶抑制率（%）=[1-（OD化合物+ERp57+DTTODDTT）/（ODERp57+DTT-ODDTT）]×100%[5]。

1.3.4血小板聚集實(shí)驗(yàn)①獲取富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）和貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）。用枸櫞酸鈉抗凝采血管從兔耳緣動(dòng)脈采血。將血液750 r/min離心15 min，收集上清得PRP；剩余血樣2 800 r/min離心10 min，收集上清得PPP。②血小板聚集率的檢測(cè)。用PPP調(diào)零，以PRP為血小板供體，檢測(cè)不同濃度綠茶水提取物對(duì)血小板聚集的干預(yù)作用，設(shè)置模型組（ADP處理）、陽性對(duì)照組（氯吡格雷處理），以及30、100和300μg/ml綠茶水提取物干預(yù)組。PRP與待測(cè)藥物作用5 min后，加入15μmol/L ADP溶液，用血小板聚集儀檢測(cè)血小板聚集情況。

1.3.5計(jì)算機(jī)虛擬篩選①三維結(jié)構(gòu)的獲得與處理。從Protein Data Bank下載ERp57的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：3F8U），按照MOE軟件的說明書對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行虛擬篩選前的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備。②綠茶中小分子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。根據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫[6]，收集綠茶中的20種小分子，用MOE軟件建立綠茶小分子數(shù)據(jù)庫，并做能量最低化操作。③虛擬篩選。運(yùn)行分子模擬軟件MOE，以蛋白ERp57的CGHC殘基為活性位點(diǎn)。從綠茶小分子庫中虛擬篩選ERp57的抑制劑。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graphpad prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　綠茶水提取物的成份

取200 g茶粉經(jīng)提取后，得到62.12 g綠茶水提取物，得率為31.06%。利用UPLC對(duì)綠茶水提取物中的成分進(jìn)行分析。綠茶水提取物UPLC色譜圖中各目標(biāo)峰的分離度和峰形較好，綠茶水提取物中的各種成分與4種標(biāo)準(zhǔn)品在相同的保留時(shí)間處均有相對(duì)應(yīng)的峰出現(xiàn)，檢出各成分與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，說明綠茶水提取物中主要含有EGC、ECG、EGCG、CAF 4種化合物。見圖1。

圖1　278 nm波長(zhǎng)處綠茶水提取物的成分分析

2.2　不同濃度綠茶水提取物對(duì)ERp57酶活性的影響

與模型組相比，ERp57蛋白酶活性隨著綠茶水提取物濃度的增加而降低，表明綠茶水提取物對(duì)ERp57的活性有抑制作用，半數(shù)抑制率為30～100μg/ml。見圖2。

2.3　綠茶水提取物對(duì)血小板聚集的影響

各組血小板聚集率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.574，P=0.000），不同處理組對(duì)血小板聚集率的影響不全相同，100和300μg/ml綠茶水提取物干預(yù)組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明綠茶水提取物對(duì)血小板聚集有抑制作用。綠茶水提取物抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，且呈劑量依賴關(guān)系。見圖3。

2.4　計(jì)算機(jī)虛擬篩選結(jié)果

綠茶小分子庫經(jīng)虛擬篩選過后，以活性位點(diǎn)和化合物的親和力為指標(biāo)，結(jié)合能力越小，得分越高，配體和受體的親和力更大，從20個(gè)化合物中獲得3個(gè)打分較高，并符合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證要求的小分子。蛋白質(zhì)ERp57以絲帶模式渲染，EGCG、ECG、EGC結(jié)合能分別為 -21.8、-19.1 和 -15.7 kcal/mol（1kcal=4.184kJ）（見圖4）。篩選后3種小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖5。

2.5　綠茶水提取物和化合物單體對(duì)ERp57活性的抑制作用

各組ERp57抑制率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.848，P=0.000），綠茶水提取物及化合物對(duì)酶活性抑制率的影響作用不同。其中，檢測(cè)的3種化合物中，EGCG對(duì)ERp57活性的抑制作用最強(qiáng)。綠茶水提取物、EGC、EGCG及ECG對(duì)ERp57活性均有一定的抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系。見圖6。

圖2　綠茶水提取物對(duì)ERp57酶活性的抑制作用

圖3　綠茶水提取物對(duì)血小板聚集的影響

圖4　篩選后的3個(gè)ERp57蛋白酶抑制劑

圖5　篩選后的3個(gè)ERp57抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖6　綠茶水提取物及化合物對(duì)ERp57的抑制率比較

3　討論

經(jīng)過長(zhǎng)約11年的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期飲用綠茶能夠顯著降低心血管疾病患者的死亡率[2]，提示綠茶具有預(yù)防心血管疾病的作用。本實(shí)驗(yàn)通過提取鳳岡富鋅硒茶，基于ERp57蛋白酶為抗血小板聚集的作用靶點(diǎn)，采用計(jì)算機(jī)虛擬篩選與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，進(jìn)一步證明，綠茶水提取物有較強(qiáng)的抑制ERp57蛋白酶活性的作用，且通過體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)，綠茶水提取物顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。其中，EGCG是抑制ERp57蛋白酶的主要活性成分。該研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)綠茶抗心血管疾病的保健功能，為綠茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）家族是一類在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)調(diào)節(jié)肽鏈氧化折疊等多重功能的巰基-二硫鍵氧化還原酶，是一種潛在的治療血栓的藥物靶點(diǎn)[7]。ERp57是PDI家族的成員之一。最近研究發(fā)現(xiàn)，ERp57蛋白酶在血小板聚集和血栓的形成中也發(fā)揮重要作用[8]，ERp57基因敲除小鼠在血小板數(shù)量及表面糖蛋白的表達(dá)上都未發(fā)生變化，但其尾靜脈出血時(shí)間延長(zhǎng)，血小板聚集率下降，在添加外源性的ERp57蛋白酶后，血小板聚集缺陷得到很好地改善[9]，提示抑制ERp57蛋白酶活性，可以顯著抑制血小板的聚集。篩選出具有拮抗ERp57蛋白酶活性的物質(zhì)，對(duì)開發(fā)抗血栓類藥物或保健品方面都有巨大的應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)采用胰島素渾濁度分析法測(cè)定綠茶水提取物對(duì)ERp57蛋白酶的抑制作用。與模型組對(duì)比，隨著綠茶水提取物濃度的不斷提高，ERp57蛋白酶的活性逐漸降低，綠茶水提取物對(duì)ERp57蛋白酶有明顯的抑制作用；且血小板聚集實(shí)驗(yàn)表明，與模型組相比，綠茶水提取物顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。進(jìn)一步通過虛擬篩選結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法，發(fā)現(xiàn)ECG、EGC和EGCG 3種化合物對(duì)ERp57蛋白酶活性均有明顯的抑制作用，并呈一定劑量依賴關(guān)系。其中，EGCG對(duì)ERp57蛋白酶活性的抑制作用最強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種化合物對(duì)ERp57蛋白酶活性的抑制作用強(qiáng)度分別為EGCG＞EGC＞ECG。3種化合物的結(jié)構(gòu)相似，基本結(jié)構(gòu)均為α-連或鄰苯酚基苯并吡喃，3者結(jié)構(gòu)中A環(huán)的5-位和7-位均帶有1個(gè)酚羥基，其結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在C環(huán)的2-位和3-位上所帶的基團(tuán)類型，主要表現(xiàn)為2-位上帶鄰苯酚基或者是連苯三酚基，3-位帶羥基或者是沒食子酯結(jié)構(gòu)。其中，EGC與ECG相比較，EGC中C環(huán)的2-位帶有連苯三酚基，而ECG中為鄰苯酚基，EGC比ECG多1個(gè)羥基；EGCG與EGC比較，差異主要表現(xiàn)在C環(huán)的3-位上，EGCG中3-位帶有沒食子酯結(jié)構(gòu)，沒食子酯結(jié)構(gòu)中帶有3個(gè)羥基，而EGC中的3-位帶有1個(gè)羥基，EGCG帶有的羥基數(shù)量大于EGC；EGCG與ECG的結(jié)構(gòu)差異表現(xiàn)在C環(huán)的2-位上，EGCG帶有1個(gè)連苯三酚基，ECG帶鄰苯酚基，EGCG比ECG多1個(gè)羥基；3者結(jié)構(gòu)相似，但對(duì)ERp57蛋白酶活性的抑制作用存在差異，由3者化學(xué)結(jié)構(gòu)分析可以說明羥基對(duì)于化合物的活性而言占有主導(dǎo)地位，羥基具有極強(qiáng)的抗氧化活性，羥基數(shù)目越多，可提供的氫原子越多，其抗氧化活性越強(qiáng)。由此可以推測(cè)，3種化合物對(duì)ERp57蛋白酶抑制作用的強(qiáng)弱源于羥基所處位置及數(shù)量。

兒茶素類化合物是含有黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)的一大類化合物，該類化合物具有多個(gè)酚羥基而顯示出強(qiáng)抗氧化活性。兒茶素與蛋白質(zhì)通過疏水鍵相結(jié)合，通過氫鍵和環(huán)氧基團(tuán)進(jìn)一步穩(wěn)定，兒茶素高親和力的氧化結(jié)構(gòu)域可使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，其中氧化和二聚體的形成伴隨著蛋白構(gòu)象的改變和表面疏水蛋白質(zhì)的增加[10]。兒茶素在發(fā)揮作用時(shí)，優(yōu)先結(jié)合到氧化酶活性位點(diǎn)附近，這可能是影響ERp57蛋白酶氧化還原功能及其他配體相互作用的主要原因，從而使ERp57活性受到抑制。研究人員發(fā)現(xiàn)，給小鼠注入ERp57蛋白酶拮抗劑，發(fā)現(xiàn)其尾部出血時(shí)間延長(zhǎng)，血小板聚集作用欠佳，αⅡbβ和P選擇素的表達(dá)受到抑制[11]。兒茶素對(duì)ERp57蛋白酶活性抑制作用機(jī)制，以及與αⅡbβ受體和P選擇素的相關(guān)性，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，鳳岡富鋅硒茶提取物對(duì)ERp57蛋白酶具有一定的抑制作用，其中EGCG是主要的活性成分。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究綠茶預(yù)防心血管疾病的機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。其次，基于計(jì)算機(jī)虛擬篩選與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法為探討中藥的作用靶點(diǎn)和有效成分研究提供了重要研究思路。

參 考 文 獻(xiàn)：

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