韓峰，顏楠，李俠，費舟

[空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院（西京醫(yī)院） 1.神經(jīng)外科，2.檢驗科， 陜西 西安 710032]

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）具有發(fā)生率高、致殘率高、死亡率高、治愈率低的特點[1-3]。TBI嚴(yán)重威脅人類健康，是影響人類幸福生活的重要原因。如今，藥物治療TBI一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點[4-6]。三七是我國傳統(tǒng)的中藥，始載于《本草綱目》，因“其葉左三右四，故名三七”而得名[7-8]。三七的主要的活性成份是三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）。研究表明，PNS對神經(jīng)元細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[9]，但其具體作用機制還不是很清楚。本研究利用過氧化氫H2O2刺激HT22細(xì)胞，建立體外神經(jīng)細(xì)胞抗氧化刺激模型，研究PNS對HT22細(xì)胞的保護(hù)作用，闡明其抗氧化損傷的作用機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　主要試劑與儀器

1.1.1試劑PNS（成都華高藥業(yè)有限公司），海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞株（空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院全軍神經(jīng)外科研究所）。胎牛血清、1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒（批號：CK04-1000T）（日本 Dojindo公司），青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）（南京建成生物工程研究所）。

1.1.2儀器微孔酶聯(lián)檢測儀（美國伯樂公司），Leica倒置熒光顯微鏡（德國萊卡相機股份有限公司）。

1.2　方法

1.2.1HT22細(xì)胞培養(yǎng)HT22細(xì)胞在含10%胎牛血清、1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實驗研究。

1.2.2H2O2模型的建立取培養(yǎng)對數(shù)期HT22細(xì)胞，胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)并接種細(xì)胞1×105個/ml于96孔板，細(xì)胞貼壁后，分別加入0、50、100、200、400和800μmol/L H2O2溶液刺激24 h，加入CCK-8 10μL/孔，37℃培養(yǎng)箱孵育1～4 h。在酶聯(lián)檢測儀450 nm處讀取光密度值（optical density，OD），實驗重復(fù)3次。細(xì)胞活性（%）=[OD加藥-OD空白]/[OD0加藥-OD空白]×100%。

1.2.3PNS對HT22的保護(hù)接種細(xì)胞于96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，貼壁后加入0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 mg/L PNS作用24 h后進(jìn)行CCK-8法檢測，實驗重復(fù)3次。

1.2.4PNS對氧化應(yīng)激HT22細(xì)胞活性的影響取培養(yǎng)對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/ml，接種于96孔板。分別設(shè)空白對照組、對照組（正常細(xì)胞培養(yǎng)HT22），模型組（H2O2500μmol/L），同時模型組在分別加入不同濃度（0.00、0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 mg/L）PNS作用2 h后，再換500μmol/LH2O2作用24 h，進(jìn)行CCK-8法檢測，在450 nm處讀取OD值，實驗重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取對數(shù)生長期HT22細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)后接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度匯合至75%時，加入10 mg/L PNS作用2 h，加入500μmol/L H2O2損傷細(xì)胞，用相差顯微鏡觀察并拍攝細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6LDH的釋放收集細(xì)胞上清液，按LDH說明書進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞損傷過程中細(xì)胞的凋亡和LDH的釋放，而活細(xì)胞沒有該功能。細(xì)胞LDH釋放率（%）=細(xì)胞培養(yǎng)基中測定的酶活性單位/（細(xì)胞裂解液測定的酶活性單位+細(xì)胞培養(yǎng)基測定的酶活性單位）×100%。數(shù)值越大，表明細(xì)胞活性越差，細(xì)胞損傷程度越高。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)分別設(shè)對照組、模型組（H2O2處理組）和PNS+H2O2組，收集各組細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/ml，磷酸鹽緩沖溶液清洗2次。按照Annexin V FITC試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別加入10μl Annexin V–FITC和5μl PI輕柔振蕩混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡水平。

1.3　統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　H2O2對HT22細(xì)胞生長活性的影響

各組HT22細(xì)胞生長活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=108.257，P=0.0378），不同濃度的H2O2對HT22細(xì)胞增殖的影響不同。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)Dunnett-t檢驗，50和100μmol/L H2O2對HT22細(xì)胞無明顯抑制效應(yīng)（P＞0.05）；200、400和800μmol/L H2O2對HT22細(xì)胞誘導(dǎo)24 h后，損傷明顯，抑制率分別達(dá)（16.277±3.315）%、（35.043±4.342）%和（73.583±3.403）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2　不同濃度PNS對HT22細(xì)胞活性的影響

各組HT22細(xì)胞生長活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.422，P=0.025），不同濃度PNS對HT22細(xì)胞均有保護(hù)作用，且伴隨PNS濃度增加，HT22細(xì)胞無明顯依賴性。在0.01～1.00 mg/L PNS作用下，HT22細(xì)胞增殖不明顯（P＞0.05），而PNS在10.00 mg/L濃度時，能促進(jìn)HT22細(xì)胞生長活性（P＜0.05）。當(dāng)100.00 mg/L PNS作用HT22細(xì)胞時，具有抑制細(xì)胞增殖活性效應(yīng)（P＜0.05）。見圖2。

2.3　PNS對H2O2損傷后HT22細(xì)胞活性的影響

HT22細(xì)胞經(jīng)500μmol/L H2O2作用后，細(xì)胞生長受抑制。各組HT22細(xì)胞生長活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.970，P=0.003）。當(dāng)PNS對HT22預(yù)保護(hù)2 h后，發(fā)現(xiàn)0.10～10.00 mg/L PNS對H2O2損傷均具有保護(hù)作用，且濃度不同，保護(hù)程度不同，其中10.00 mg/L PNS的保護(hù)效果最顯著（P＜0.05）。而PNS在100 mg/L時，對細(xì)胞無保護(hù)作用，反而經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后會加重細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞活性。見圖3。

2.4　PNS對H2O2損傷后HT22細(xì)胞LDH含量的影響

H2O2損傷HT22細(xì)胞后，出現(xiàn)大量的細(xì)胞裂解，細(xì)胞活性降低，導(dǎo)致LDH含量升高。不同濃度PNS對HT22細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，各組LDH含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=167.536，P=0.008），LDH 的釋放均降低。 與 PNS+H2O2組（0.01～10.00 mg/L PNS）比較，隨著PNS濃度增加，LDH含量逐漸降低。LDH檢測結(jié)果顯示，對照組LDH含量較少，模型組細(xì)胞中LDH含量是對照組的7～8倍（P＜0.05）。實驗結(jié)果證實，PNS能提高H2O2誘導(dǎo)下的HT22細(xì)胞存活率，對HT22細(xì)胞具有保護(hù)作用。見圖4。

圖1　不同濃度H2O2對HT22細(xì)胞增殖活性的影響

圖2　PNS對HT22細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)

圖3　PNS對H2O2損傷后HT22細(xì)胞活性的影響

圖4　PNS對H2O2損傷后HT22細(xì)胞LDH含量的影響

2.5　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

通過倒置熒光顯微鏡觀察HT22細(xì)胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞形態(tài)完整，多呈多邊形，折光性好。經(jīng)500μmol/L H2O2作用24 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞核皺縮。10.00 mg/L PNS預(yù)處理2 h后，加入500μmol/L H2O2作用24 h后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比細(xì)胞密度減少，但細(xì)胞形態(tài)有伸展的梭形。見圖5。

2.6　細(xì)胞凋亡變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，對照組HT22細(xì)胞幾乎沒有凋亡，而500μmol/L H2O2作用24 h后細(xì)胞凋亡率升高，早晚期占（36.313±3.623）%，壞死率為（4.043±1.261）%，10.00 mg/L PNS預(yù)處理2 h后，加入500μmol/L H2O2作用24 h，細(xì)胞凋亡率遞減，早晚期占（15.732±2.284）%，壞死率為（2.042±0.546）%，表明PNS對HT22細(xì)胞具有保護(hù)作用，能減輕H2O2對HT22細(xì)胞的損傷程度。見圖6。

圖5　PNS對H2O2損傷后HT22細(xì)胞形態(tài)變化的影響

圖6　HT22細(xì)胞凋亡情況

3　討論

TBI包括創(chuàng)傷部位的直接損傷和創(chuàng)傷后缺血缺氧、鈣通道異常，以及過氧化病理過程所介導(dǎo)的繼發(fā)性損傷[10]。TBI治療手段包括手術(shù)、亞低溫和藥物治療等。目前，中草藥輔助治療腦損傷已成為國內(nèi)外研究的熱點[11]，但仍需要研究者不斷研究與探討，使腦損傷患者能獲得更佳的治療效果。

PNS具有多方面的藥理功效，不僅具有抗血小板凝聚、溶栓及提高纖溶酶原激活作用，還能促進(jìn)造血功能、抑制心肌收縮、擴(kuò)張腦血管、耐缺氧和抗休克[12-13]。如今，三七在鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫調(diào)節(jié)功能方面研究得越來越多[14-15]。本研究以H2O2對HT22細(xì)胞造成損傷，成功建立缺血性損傷離體模型，以PNS作用H2O2損傷后的HT22細(xì)胞，結(jié)果證實H2O2對HT22細(xì)胞的損傷，以及PNS對HT22細(xì)胞的保護(hù)。PNS降低H2O2對HT22細(xì)胞的損傷，以此保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞。

常用的細(xì)胞氧化損傷模型有2種：H2O2損傷模型和過氧化脂損傷模型，其中H2O2的應(yīng)用最為廣泛[16]。同時H2O2和細(xì)胞的氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）密切相關(guān)[17]。OS是機體遭受外界刺激后，體內(nèi)的氧化和抗氧化作用失衡，導(dǎo)致體內(nèi)高活性分子產(chǎn)生逐漸增多，引起組織細(xì)胞損傷，自由基在體內(nèi)產(chǎn)生負(fù)面作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個重要因素[18]。腦外傷后，損傷部位的腦組織會產(chǎn)生大量的自由基，引起神經(jīng)元水腫和壞死，造成神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的重要原因。

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