貴州省畜牧獸醫(yī)研究所 550005

綠膿桿菌又被稱作銅綠假單細(xì)胞菌，能夠?qū)е露喾N動(dòng)物的臟器出現(xiàn)膿腫，所以綠膿桿菌可以從傷口的膿液中分離獲得。各年齡段的雞都會(huì)受到綠膿桿菌的感染，導(dǎo)致肺炎、心肌炎以及肝周炎等疾病，死亡率高達(dá)80%。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品選取某雞場(chǎng)送檢的4只病死雞，對(duì)其進(jìn)行剖檢，并在無菌環(huán)境下采集病死雞的肝臟與肺臟；實(shí)驗(yàn)采用的試劑包括瓊脂糖、DL2000DNA Marker、10×Loading Buffer、腸桿菌科、JAMES液以及快速革蘭氏染色液等；實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)基包括血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）細(xì)菌的分離培養(yǎng)。在病死雞的肝臟和肺臟中分離出細(xì)菌，通過劃線方法將其接種于麥康凱平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板以及血液瓊脂平板上，分別將3個(gè)平板放置于37℃的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。然后選取其中的典型菌落，分別設(shè)置為1-4號(hào)，在典型菌落純培養(yǎng)的過程中進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌。

（2）細(xì)菌的生化實(shí)驗(yàn)。根據(jù)腸桿菌科相關(guān)鑒定試劑盒中帶有的說明書，對(duì)細(xì)菌分離培養(yǎng)中的純培養(yǎng)物進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的儀器為ATB自動(dòng)生化檢定儀，明確雞源細(xì)菌的種屬。

（3）免疫熒光抗體染色。在載玻片中滴加1滴PBS，并在培養(yǎng)基中挑取單個(gè)菌落均勻涂布在載玻片的PBS上，在菌落自然干燥后使用甲醇進(jìn)行15分鐘干燥；再使用PBS沖洗5分鐘，共沖洗3次；然后在載玻片上添加一抗，在37℃的條件下孵育30分鐘，再使用PBS沖洗之后添加二抗，在37℃的條件下孵育30分鐘；最后使用PBS沖洗后使用蒸餾水漂洗，干燥后放置于熒光顯微鏡下觀察。能夠產(chǎn)生藍(lán)綠色熒光素以及藍(lán)色綠膿素的細(xì)菌為綠膿桿菌。

（4）藥敏試驗(yàn)。制作綠膿桿菌的肉湯培養(yǎng)物，根據(jù)Kirby-Barer氏法，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板的表面均勻涂布培養(yǎng)物。使用無菌鑷子將20種抗生素的藥敏試紙粘貼于培養(yǎng)基表面（需要注意的是，藥敏試紙需要等距粘貼），然后將培養(yǎng)基放置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)。培養(yǎng)期間觀察并記錄試紙上的抑菌圈直徑，按照NCCLS（2009）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析。

（5）PCR試驗(yàn)。應(yīng)用細(xì)菌純培養(yǎng)物進(jìn)行PCR試驗(yàn)，首先將其接種于普通LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)，然后根據(jù)樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒中帶有的說明書，進(jìn)行分離菌株基因組DNA的提取，進(jìn)一步鑒定綠膿桿菌。試驗(yàn)采用的上游引物序列為 5’-CCGTGCTTCAGT-TCCAGTGTG-3’， 下游引物序列為 5’-GTGGCGGACG-GGTGAGTAA-3’。 最后根據(jù)基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，并通過1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，明確PCR產(chǎn)物的序列[1]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果。分離培養(yǎng)后，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落呈現(xiàn)出表面光滑、邊緣參差的形態(tài)，整體呈綠色，具有一定的芳香氣味；麥康凱平板上的菌落呈半透明形態(tài)，整體為圓形；血液瓊脂平板上的菌落為不規(guī)則形狀，呈灰色，帶有溶血環(huán)。通過顯微鏡觀察，1～4號(hào)分離菌均為革蘭氏陰性小桿菌，初步判定細(xì)菌為綠膿桿菌。

（2）生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1～4號(hào)分離菌的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，都可以分解酯酶、尿素酶以及D-葡萄糖，可以將其鑒定為綠膿桿菌，符合率高達(dá)99.9%。

（3）抗體染色結(jié)果。1～4號(hào)分離菌染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)的形態(tài)為兩端鈍圓，顏色為熒光綠色，屬于短小桿菌，與綠膿桿菌的特征相符。

（4）藥敏試驗(yàn)結(jié)果。1～4號(hào)分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果相差無幾，對(duì)大觀霉素、慶大霉素以及頭孢曲松等藥品高度敏感，對(duì)強(qiáng)力霉素以及四環(huán)素中度敏感，對(duì)紅霉素以及頭孢噻吩等藥品不敏感，具有一定的耐藥性。

（5）PCR試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)PCR試驗(yàn)獲得的序列，將其與GenBank中公布的16株參考菌株進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示，2號(hào)分離菌的同源性在99.7%～100%之間，可以將其鑒定為綠膿桿菌。

4 結(jié)論

綜上所述，綠膿桿菌對(duì)于阿莫西林、頭孢噻吩以及紅霉素有較強(qiáng)的耐藥性，對(duì)頭孢曲松、阿米卡星以及慶大霉素等高度敏感，可以使用這類藥品進(jìn)行防治。