柳君輝 董國(guó)忠 田 可

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400716)

由于我國(guó)人均耕地少，加上地域性與季節(jié)性因素限制，我國(guó)青粗飼料資源匱乏，并且品質(zhì)相對(duì)較差[1]。在反芻動(dòng)物實(shí)際生產(chǎn)中，常常通過增加飼糧中精料比例來(lái)滿足動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要以提高生產(chǎn)性能。但是隨著精料比例的增加，瘤胃中碳水化合物大量發(fā)酵而產(chǎn)生乳酸及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，造成瘤胃內(nèi)pH下降和代謝紊亂，出現(xiàn)亞急性瘤胃酸中毒(SARA)以及腹瀉、蹄葉炎、肝膿腫等多種代謝性疾病[2-4]。研究表明，高精料飼糧模式下特別是發(fā)生SARA時(shí)反芻動(dòng)物胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系發(fā)生改變[5]。因此，研究高精料飼糧對(duì)反芻動(dòng)物胃腸道內(nèi)微生物區(qū)系的影響及其調(diào)控措施，對(duì)提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和機(jī)體健康水平具有重要意義。

1 胃腸道微生物區(qū)系

1.1 瘤胃內(nèi)微生物

瘤胃中主要的微生物包括細(xì)菌、古生菌、原蟲和真菌[6]。細(xì)菌多為厭氧菌，并在微生物中占主導(dǎo)地位[7-8]。根據(jù)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解作用可將細(xì)菌分為纖維素降解菌、淀粉降解菌、半纖維素降解菌、蛋白質(zhì)降解菌、脂肪降解菌、酸利用菌和產(chǎn)酸菌等。

對(duì)瘤胃內(nèi)微生物進(jìn)行測(cè)序并與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)微生物有13 478個(gè)細(xì)菌序列以及3 516個(gè)古細(xì)菌序列。細(xì)菌序列中包括19個(gè)細(xì)菌門，豐度最高的3個(gè)分別為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)[7]。

厚壁菌門中90.6%的序列屬于梭菌綱(Clostridia)，剩余的分別屬于芽孢桿菌綱(Bacilli)、產(chǎn)芽胞菌綱(Erysipelotrichi)以及未分類的厚壁菌。擬桿菌門是瘤胃內(nèi)第二大細(xì)菌門，其中88.5%的序列屬于擬桿菌綱(Bacteroidia)，其余的分別屬于鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria,1.5%)和未分類的擬桿菌(10%)。變形菌門包括α變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ變形菌綱(Gammaproteobacteria，豐度最高)、δ變形菌綱(Deltaproteobacteria)和ε變形菌綱(Epsilonproteobacteria，豐度最低)[7]。

古細(xì)菌中大約99.6%的序列屬于廣古菌門(Euryarchaeota)，其余屬于泉古菌門(Crenarchaeota)。古細(xì)菌多為產(chǎn)甲烷菌(Methanogens)，利用細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳(CO2)和氫氣(H2)產(chǎn)生甲烷，甲烷的合成避免H2分壓的增加而抑制微生物酶的合成[6]。

此外，瘤胃內(nèi)還大量存在原蟲和真菌，但是它們的營(yíng)養(yǎng)代謝作用還存在很大的爭(zhēng)論[9]。瘤胃內(nèi)的原蟲非?；钴S，與產(chǎn)甲烷菌有著密切的關(guān)系，能夠影響飼糧發(fā)酵從而影響終產(chǎn)物包括甲烷的產(chǎn)生[6]。

1.2 瘤胃黏膜上皮微生物

瘤胃上皮的細(xì)菌主要由革蘭氏陽(yáng)性菌組成，與瘤胃內(nèi)容物細(xì)菌有差異[10]。Liu等[11]通過qPCR分析發(fā)現(xiàn)，可能由于采樣部位不同，奶牛瘤胃內(nèi)容物的16S rRNA基因數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于瘤胃上皮。除了數(shù)量的差異，在生物分類上二者也存在不同。在門的水平上，瘤胃內(nèi)容物的擬桿菌門豐度高于瘤胃上皮，而變形菌門在瘤胃上皮中具有較高豐度。由于擬桿菌能夠水解植物細(xì)胞壁的可溶性多糖，因此瘤胃內(nèi)容物中高豐度的擬桿菌有助于降解并發(fā)酵有機(jī)物質(zhì)。在屬的水平上，丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)在瘤胃上皮中具有較高豐度。該菌能夠產(chǎn)生并釋放丁酸，提高宿主的丁酸供應(yīng)，對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞的增殖有重要作用[11]。

1.3 腸道內(nèi)微生物

目前，大部分研究都針對(duì)瘤胃內(nèi)微生物，而對(duì)腸道微生物區(qū)系及其作用重視不夠。因此，我們對(duì)腸腔中微生物的了解非常有限[12]。

反芻動(dòng)物前胃微生物的多樣性顯著高于小腸與大腸。奶牛胃腸道中共有21個(gè)細(xì)菌門，其中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、螺旋體門(Spirochaetae)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)和柔膜菌門(Tenericutes)在胃腸道各段中均有發(fā)現(xiàn)[12]。

通過對(duì)比肉牛腸道中微生物焦磷酸測(cè)序后產(chǎn)生的30 315個(gè)序列與Greengenes基因庫(kù)，并使用MOTHUR進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)序列分別屬于厚壁菌門(41.22%)、擬桿菌門(33.51%)和變形菌門(12.15%)[13]。擬桿菌門主要存在于網(wǎng)胃以及皺胃中，而小腸(十二指腸、空腸、回腸)和大腸(盲腸、結(jié)腸)及糞便中厚壁菌門占主導(dǎo)地位[13]。厚壁菌門中的毛螺菌科在前胃中豐度最高，小腸和大腸中則分別是梭菌科(Clostridiaceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)占主要地位[14]。在擬桿菌門中，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)在小腸中豐度最高，大腸中則是擬桿菌科(Bacteroidaceae)豐度最高[12]。

1.4 腸道黏膜上皮微生物

正常的腸道菌群具有促進(jìn)腸黏膜修復(fù)和生長(zhǎng)的作用，細(xì)菌通過降解碳水化合物產(chǎn)生VFA，為腸黏膜提供能量，改善組織局部供血，促進(jìn)上皮細(xì)胞修復(fù)，增加胰液中胰酶的分泌，促進(jìn)腸道生長(zhǎng)。

奶牛腸道黏膜上共有22個(gè)細(xì)菌門。除十二指腸外，厚壁菌門在所有胃腸道黏膜菌落中都占據(jù)主導(dǎo)地位，而在十二指腸中變形菌門(Proteobacteria)豐度(37.26%)最高。擬桿菌門在網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、結(jié)腸和直腸中豐度僅次于厚壁菌門，在瘤胃、空腸和回腸中第二大細(xì)菌門則是變形菌門。相比之下，瓣胃、盲腸、結(jié)腸和直腸黏膜組織中OTU的數(shù)量均高于其各自的腸道內(nèi)容物[12]。

2 高精料飼糧下微生物區(qū)系變化

2.1 瘤胃內(nèi)微生物變化

高精料飼糧模式下，大量可溶性糖和淀粉快速發(fā)酵產(chǎn)生葡萄糖，為微生物生長(zhǎng)提供足夠的能量及碳源，加快了瘤胃內(nèi)幾乎所有微生物的增殖速度。但是，伴隨著VFA的大量產(chǎn)生和積聚，瘤胃pH下降[15]。特別是發(fā)生SARA后，瘤胃代謝紊亂，產(chǎn)生大量異常代謝產(chǎn)物，包括脂多糖(LPS)、組胺、酪胺、乙醇和D-乳酸等[15]。

高精料飼糧模式會(huì)改變反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)微生物菌群的豐度和多樣性。以肉牛為例，在門水平上，低精料模式下肉牛瘤胃中含有大量纖維桿菌(Fibrobacters)，而高精料模式下厚壁菌占主導(dǎo)[16]。并且飼糧精粗比不同導(dǎo)致微生物的變化程度也不一致。精料比例越高，肉牛瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系變化越明顯[16]。Franzolin等[17]將肉牛的飼糧由全干草逐漸過渡為75%的高精料飼糧后發(fā)現(xiàn)原蟲數(shù)量由3.61×105個(gè)/mL增至8.03 ×105個(gè)/mL。

飼喂高精料飼糧顯著降低了山羊瘤胃內(nèi)微生物菌群的豐度和多樣性[18]。低精料及高精料飼糧模式下得到的OUT數(shù)量分別為398及315個(gè)，二者只有24個(gè)OTU相同。飼喂高谷物飼糧顯著降低了擬桿菌門和柔膜菌門的相對(duì)豐度，提高了綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門的相對(duì)豐度和厚壁菌門/擬桿菌門。在屬水平上，飼喂高谷物飼糧顯著提高了瘤胃菌群中丁酸弧菌屬(Acetitomaculum)、艱難桿菌屬(Mogibacterium)和未分類的厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)的相對(duì)比例，同時(shí)帕匹桿菌屬(Papillibacter)、海旋菌(Thalassospira)和未分類的擬桿菌(Bacteroidales)的相對(duì)比例顯著下降[18]。

當(dāng)山羊飼糧內(nèi)谷物比例分別為0、25%和50%時(shí)，無(wú)谷物組的微生物豐度顯著高于50%谷物組；隨著谷物比例的增加，瘤胃微生物豐度和多樣性總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)[19]。其中12個(gè)細(xì)菌門在3種不同的飼糧模式下均有出現(xiàn)，但是豐度存在差異。在50%谷物組中沒有發(fā)現(xiàn)衣原體門(Chlamydiae)，而是大量存在厚壁菌門(57.0%)及擬桿菌門(32.2%)細(xì)菌。隨著谷物比例的增加，厚壁菌門以及綠彎菌門豐度呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，而擬桿菌門以及一些未分類的細(xì)菌豐度降低[19]，與上述肉牛瘤胃內(nèi)微生物變化趨勢(shì)相一致。

此外，高精料飼糧會(huì)增加山羊瘤胃內(nèi)纖毛蟲以及產(chǎn)甲烷菌數(shù)量，降低厭氧真菌的密度，豐富古細(xì)菌菌群[19-20]。當(dāng)發(fā)生SARA時(shí)，瘤胃內(nèi)容物的液相部分產(chǎn)甲烷菌數(shù)量隨著瘤胃pH的下降而表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)，而固相部分則呈現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌密度增加的趨勢(shì)[21]。原蟲對(duì)低pH環(huán)境耐受性較高[22]，能夠降低產(chǎn)甲烷菌對(duì)低pH環(huán)境的敏感性而使產(chǎn)甲烷菌獲得保護(hù)[23]。

飼喂高精料飼糧引起SARA以及炎癥反應(yīng)時(shí)，增加了山羊瘤胃中大腸桿菌(Escherichiacoli)的豐度[18]。大量飼喂谷物導(dǎo)致瘤胃pH下降，這種環(huán)境使大腸桿菌數(shù)量激增，并且它的致病基因?qū)е聞?dòng)物出現(xiàn)免疫反應(yīng)[24]。

奶牛采食高精料(65%)飼糧而發(fā)生SARA后，普氏菌屬(Prevotella)豐度比正常情況下增加了1.5倍，是豐度最高的細(xì)菌[23]。SARA嚴(yán)重時(shí)，纖維降解菌豐度急劇下降，其中白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)下降83%，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)下降91%，溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)下降29%[23]。此外，乳酸菌群(Lactobacillus)及埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)的相對(duì)豐度提高約11倍，反芻獸新月形單胞菌(Selenomonasruminantium)相對(duì)豐度提高1.6～2.6倍[23]。乳酸菌是一類重要的淀粉分解菌，分解產(chǎn)生的乳酸能被埃氏巨型球菌及反芻獸新月形單胞菌這些乳酸利用菌利用而產(chǎn)生丙酸鹽。增加這些乳酸利用菌能夠維持瘤胃內(nèi)pH，是一種對(duì)瘤胃的保護(hù)機(jī)制[16]。但是目前也有研究認(rèn)為這一機(jī)制的作用不是很明顯。在反復(fù)發(fā)生SARA的公牛中，瘤胃細(xì)菌群落多樣性增加，細(xì)菌組成改變及多樣性增加使宿主動(dòng)物能夠逐漸適應(yīng)高精料飼糧模式[21]。

2.2 瘤胃黏膜上皮微生物變化

肉牛瘤胃黏膜上皮中普氏菌屬以及丁酸弧菌屬在高精料飼糧模式下及SARA時(shí)顯著高于粗飼料組[10]。將飼糧中谷物比例逐漸由3%增至75%和92%時(shí)，瘤胃上皮中才能夠檢測(cè)到瘤胃桿菌屬(Ruminobacter)、密螺旋體屬(Treponema)和毛螺菌屬(Lachnospiraceae)[25-26]。

2.3 腸道內(nèi)微生物變化

飼糧精料比例升高導(dǎo)致腸道中pH降低,乳酸及VFA含量上升,擬桿菌數(shù)量降低，對(duì)厚壁菌門/擬桿菌門也有影響，但是不同腸道部位表現(xiàn)不一致。

高精料飼糧會(huì)顯著提高山羊回腸內(nèi)容物的總VFA含量，增加乳酸含量，并降低pH。通過定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，回腸中擬桿菌門16S rRNA基因表達(dá)量顯著降低，而厚壁菌門豐度沒有顯著變化，厚壁菌門/擬桿菌門顯著升高?？漳c中厚壁菌門與擬桿菌門基因表達(dá)量以及它們的比值未出現(xiàn)顯著變化[27]。

Dixion等[28]在山羊采食粗飼料與65%高精料2種飼糧后發(fā)現(xiàn)，高精料的飼喂方式導(dǎo)致更多可發(fā)酵的碳水化合物進(jìn)入大腸，從而增加大腸的發(fā)酵，降低pH，并增加總VFA及LPS含量。盲腸是反芻動(dòng)物消化吸收的重要部位[28]，進(jìn)入盲腸的發(fā)酵底物會(huì)對(duì)微生物組成造成巨大的改變[29]。在對(duì)全干草飼喂組及65%高谷物飼糧試驗(yàn)組的16S rRAN基因進(jìn)行焦磷酸測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，高谷物飼糧組腸腔與黏膜中，Turicibacter屬與梭菌屬(Clostridium)占據(jù)主導(dǎo)地位，與全干草組相比豐度顯著提高[29]。此外，腸腔中擬桿菌屬和黏膜上Mucispirillum屬豐度與全干草組相比下降[29]。

2.4 腸道黏膜上皮微生物變化

采用高精料飼糧飼喂時(shí)，OUT數(shù)量及微生物豐度和多樣性顯著下降，微生物菌群受到顯著影響[30]。通過MiSeq測(cè)序表明，采食高精料飼糧后山羊結(jié)腸黏膜細(xì)菌群落中厚壁菌門(67.34%)占據(jù)主導(dǎo)地位，其次分別為擬桿菌門(13.24%)、變形菌門(10.92%)、螺旋體門(2.87%)和放線菌門(1.42%)[30]。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧改變了結(jié)腸黏膜細(xì)菌群落，擬桿菌門豐度在高精料模式下升高，布勞特氏菌屬豐度由0.07%升至1.21%，并降低了芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)和乳酸球菌屬(Lactococcus)豐度[30]。

結(jié)腸上寄生著大量黏膜相關(guān)細(xì)菌，起著物理和免疫屏障作用。但是在發(fā)生SARA的奶牛糞便中能夠觀察到黏蛋白；黏蛋白是上皮組織中具有凝膠能力的糖蛋白，因此可以推斷高精料飼喂模式可能導(dǎo)致反芻動(dòng)物后腸黏膜損傷[30]。由于上皮組織受損以及滲透性改變，LPS可通過消化道上皮進(jìn)入血液循環(huán)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[31]。

3 高精料飼糧下調(diào)控胃腸道微生物區(qū)系的措施

3.1 植物提取物和自溶酵母

飼喂富含碳水化合物的飼糧會(huì)導(dǎo)致瘤胃微生物區(qū)系紊亂，并產(chǎn)生大量異常代謝產(chǎn)物[32]。Neubauer等[33]開展了奶牛瘤胃內(nèi)添加自溶酵母和植物提取物(包括來(lái)源于薄荷、丁香等植物的香料、精油以及非揮發(fā)性提取物)的研究。自溶酵母作為纖維素降解菌的底物間接地使瘤胃內(nèi)纖維降解菌如瘤胃球菌數(shù)量增多，并增加對(duì)VFA的耐受性[34]。瘤胃球菌被認(rèn)為是“腸道核心微生物”，在反芻動(dòng)物胃腸道中多糖的降解和發(fā)酵上起著重要作用[13，35]。添加上述植物提取物，減少了淀粉及糖的發(fā)酵菌，包括擬桿菌、Shuttleworthiaspp.和互營(yíng)球菌屬(Syntrophococcusspp.)。它們通過抑制微生物對(duì)底物的發(fā)酵，使產(chǎn)酸的速率減緩，降低VFA、LPS和組胺含量，并增加丁酸鹽含量[16，33]。丁酸為上皮細(xì)胞代謝提供能源物質(zhì)，維持腸道黏膜完整性[36-37]。

3.2 煙酸

煙酸具有調(diào)節(jié)瘤胃內(nèi)乳酸代謝、避免乳酸的積聚、穩(wěn)定瘤胃pH的作用。此外，煙酸還能促進(jìn)瘤胃內(nèi)微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)瘤胃微生物合成蛋白質(zhì)，維持微生物區(qū)系的穩(wěn)定[38]。

高精料飼糧會(huì)顯著增加淀粉利用菌(普氏菌屬等)豐度，并降低纖維降解菌(瘤胃球菌以及密螺旋體等)豐度。在肉牛高精料飼糧中添加煙酸可減少普氏菌數(shù)量，增加琥珀酸菌、醋酸弧菌和密

螺旋體數(shù)量，從而抑制淀粉的利用，促進(jìn)纖維降解[39]。另外，在高精料飼糧中添加煙酸會(huì)抑制主要的乳酸產(chǎn)生菌——牛鏈球菌的增殖，還會(huì)增加原蟲的數(shù)量。

3.3 有機(jī)酸

莫能菌素是使用最廣泛的一種離子載體類抗生素，其通過抑制瘤胃內(nèi)牛鏈球菌的活動(dòng)而減少乳酸產(chǎn)生和防止瘤胃pH下降。但是，目前很多國(guó)家禁止使用這類抗生素添加劑。因此，可用有機(jī)酸代替莫能菌素。有機(jī)酸的安全性高，并且不會(huì)造成藥物殘留，但是成本較高，尤其是蘋果酸。有機(jī)酸一方面通過增加反芻獸新月形單胞菌所需的糖類及蛋白質(zhì)合成，在瘤胃中促進(jìn)該菌的生長(zhǎng)；另一方面通過增加反芻獸新月形單胞菌對(duì)乳酸的吸收利用，防止瘤胃pH下降，并減少異常代謝產(chǎn)物[40]。在山羊飼糧中添加蘋果酸使乳酸的利用率比未添加的對(duì)照組升高了29%～31%[41-42]。

3.4 益生菌

益生菌主要包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等，具有調(diào)節(jié)消化道菌群平衡、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收以及抑制病原微生物的作用[43]。益生菌進(jìn)入瘤胃后能夠平衡瘤胃內(nèi)的微生物群落，進(jìn)而維持瘤胃內(nèi)pH，對(duì)各種消化過程尤其是對(duì)纖維素水解和微生物蛋白的合成有著積極作用[44]。這些改善主要是由于增加了纖維分解菌(纖維桿菌和瘤胃球菌)以及乳酸利用菌(巨型球菌和新月形單胞菌)數(shù)量[45]。

3.5 乳酸利用菌和乳酸

在瘤胃內(nèi)接種乳酸利用菌有助于維持瘤胃環(huán)境，減少瘤胃內(nèi)異常代謝產(chǎn)物。埃氏巨型球菌是一種主要的乳酸利用菌，能與牛鏈球菌競(jìng)爭(zhēng)性爭(zhēng)奪葡萄糖等底物，抑制牛鏈球菌的生長(zhǎng)。接種乳酸利用菌能夠消耗瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的乳酸，防止乳酸積聚和瘤胃pH下降。此外，在飼糧中漸進(jìn)性地添加乳酸，能夠提高瘤胃應(yīng)對(duì)乳酸的能力，以適應(yīng)消化過程中乳酸的積聚[46]。另外，用乳酸處理飼糧中谷物，可使淀粉結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其在瘤胃內(nèi)不易發(fā)酵，從而降低谷物的降解率而增加過瘤胃淀粉數(shù)量，有效地控制VFA產(chǎn)量，使pH維持在較高水平[47-48]。在瘤胃高pH水平下，革蘭氏陰性菌能夠保持相對(duì)穩(wěn)定，從而減少LPS以及組胺的產(chǎn)生[15]。

4 小 結(jié)

在反芻動(dòng)物實(shí)際生產(chǎn)中使用高精料飼糧會(huì)導(dǎo)致胃腸道內(nèi)環(huán)境紊亂和微生物區(qū)系改變，產(chǎn)生瘤胃異常代謝產(chǎn)物，甚至發(fā)生營(yíng)養(yǎng)代謝病。隨著飼糧中精料比例增加，瘤胃及腸道中微生物多樣性呈下降趨勢(shì)，瘤胃內(nèi)呈現(xiàn)淀粉分解菌增多而纖維降解菌減少，腸道中主要表現(xiàn)為擬桿菌數(shù)量降低。系統(tǒng)研究高精料飼糧條件下胃腸道菌群的變化及其調(diào)控效果，可為控制高精料飼糧引起的代謝性疾病提供新的思路。