王淑婷,孫曉亮,曹旭敏,王曉茵,王玉東，趙思俊*

(1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032；2.農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(青島),山東青島 266032)

β內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactam antibiotics)是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素，這是一種通過(guò)抑制胞壁黏肽合成酶，對(duì)細(xì)菌胞壁進(jìn)行破壞，從而導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生膨脹裂解的藥物[1]。它主要包括青霉素類和頭孢菌素類，這些藥物具有很強(qiáng)的殺菌活性，兼具毒性較低、適應(yīng)癥廣等許多優(yōu)點(diǎn)。在動(dòng)物生產(chǎn)中，其經(jīng)常被用于治療動(dòng)物呼吸道、尿道、腸胃系統(tǒng)等感染，也用于治療奶牛乳房炎等[2]。但是由于許多飼養(yǎng)者不能按照正常的要求使用，或不遵守休藥期規(guī)定等原因，造成動(dòng)物體內(nèi)會(huì)殘留有一定量的β內(nèi)酰胺類抗生素，從而間接地危害人類身體健康。這些殘留的抗生素會(huì)使得部分人產(chǎn)生一些過(guò)敏反應(yīng)，有些甚至?xí)谷梭w產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，引起食源性污染和二重污染，造成中毒反應(yīng)、致畸形和致殘等一系列危害[3]。β內(nèi)酰胺類藥物在牛奶中被檢測(cè)出的概率較大[4]。

在藥物殘留分析檢測(cè)的過(guò)程中，樣品的前期處理非常重要，處理得當(dāng)可以提高對(duì)樣品分析的準(zhǔn)確性，也是整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中最可能出現(xiàn)誤差的環(huán)節(jié)。因此，為了可以精確測(cè)出β內(nèi)酰胺類藥物的殘留，對(duì)牛奶中藥物殘留實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確監(jiān)管，需要進(jìn)行有效的前期處理。不僅如此，為達(dá)到精確測(cè)量，還需要選擇合理的檢測(cè)方法。其中國(guó)內(nèi)外對(duì)于β內(nèi)酰胺類藥物分析檢測(cè)的研究已經(jīng)很多了，其中按照檢測(cè)目的分類可以分為篩選法和確證檢測(cè)法。確證檢測(cè)法對(duì)檢測(cè)儀器的精密性要求非常高，其中液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、液-質(zhì)聯(lián)用法等技術(shù)都屬于確證檢測(cè)法，而微生物法和免疫分析法屬于篩選法。

1 牛奶中β內(nèi)酰胺類藥物殘留樣品前處理技術(shù)

1.1 樣品提取

為了將樣品中的目標(biāo)溶解物分離，需要根據(jù)藥物的理化性質(zhì)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、樣品種類分別提取。β內(nèi)酰胺類藥是一種極性或中等極性的化合物，可以利用堿性、酸性溶液，或是乙腈、甲醇等極性溶劑提取。很多有關(guān)動(dòng)物源性食品中存在的β內(nèi)酰胺類藥物殘留分析中，通常采用乙腈[5]、乙腈-水[6]、酸化乙腈[7]、酸化甲醇等溶劑進(jìn)行提取。因?yàn)榭紤]到動(dòng)物組織中一些大分子化合物可以與β內(nèi)酰胺類藥物發(fā)生反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，因此還需要加入硫酸、鎢酸鈉等物質(zhì)。

由于β內(nèi)酰胺環(huán)在很多藥物結(jié)構(gòu)中不太穩(wěn)定，在酸性溶液中非常容易發(fā)生降解反應(yīng)，因此酸性有機(jī)溶液僅可用于提取氨芐西林等穩(wěn)定性較好的藥物。而甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑可以很好的進(jìn)行脫脂和脫蛋白反應(yīng)，其中周昱等[5]用乙腈為提取劑對(duì)牛奶中頭孢尼西藥物進(jìn)行提取處理，然后將處理后的溶液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，藥物的回收率為87.4%～93.5%。由于受到β內(nèi)酰胺藥物的穩(wěn)定性影響，對(duì)于無(wú)機(jī)溶劑的提取液還需要進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，在蛋白沉淀方面效果較差，因此無(wú)機(jī)試劑在應(yīng)用領(lǐng)域不如有機(jī)溶劑廣泛。

1.2 樣品凈化

由于采集到的樣品存在很多雜質(zhì)，這些雜質(zhì)通常會(huì)增加基線噪聲，對(duì)檢測(cè)器、柱效等有很大干擾，對(duì)儀器的色譜柱產(chǎn)生污染，導(dǎo)致產(chǎn)生色譜管路阻塞等問(wèn)題，因此在樣品提取后需要對(duì)試樣進(jìn)行凈化操作。在目前主流的處理方法中固相萃取(solid-phase extraction，SPE)和液-液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)最為常見(jiàn)，而分子印跡技術(shù)、固相分散技術(shù)等方法使用范圍較窄。

1.2.1 液-液萃取法 液-液萃取法(LLE)是一種非常簡(jiǎn)單、傳統(tǒng)的凈化方法。這種方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)試驗(yàn)條件要求不高，是凈化試樣最為常見(jiàn)的方法。Dasenaki M E等[8]用液-液萃取的方法成功提取了魚(yú)類、乳制品中包括頭孢菌素類藥物在內(nèi)約143種藥品的殘留物，同時(shí)用四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行了準(zhǔn)確的篩查。首先在樣品中加入1 g/L的乙二胺四乙酸和1 mL/L甲酸水溶液，在對(duì)溶液進(jìn)行均勻混合后，離心后靜置于-20℃的環(huán)境中12 h以上，用來(lái)獲得分離出的上層溶液，實(shí)現(xiàn)脫脂和去除蛋白質(zhì)，達(dá)到溶液的凈化。在國(guó)內(nèi)的研究中，肖惠貞等[9]用HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，在經(jīng)過(guò)純水超聲提取樣品后，用乙腈對(duì)蛋白進(jìn)行沉淀，實(shí)現(xiàn)對(duì)青霉素類藥物及其代謝物的提取檢測(cè)。HPLC-MS/MS方法的檢測(cè)結(jié)果表明，乳制品中的12種β內(nèi)酰胺類藥物的回收率可以達(dá)到80.0%～110.0%，藥品的檢出限在0.03 μg/kg～0.15 μg/kg之間。但是上述方法均采用大量的有機(jī)溶劑，而且操作非常繁瑣，同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較差，不利于多次試驗(yàn)，且容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。因此，液-液萃取方法已經(jīng)正逐步被SPE方法所代替。

1.2.2 固相萃取法 固相萃取法(SPE)是基于液-固色譜理論，其中的固體吸附劑吸附液體樣品中的目標(biāo)化合物，從而達(dá)到與樣品基體及其他干擾物質(zhì)分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的富集的一種方法。目前,固相萃取柱已經(jīng)商品化，主要包括C18柱、混合型離子柱、強(qiáng)陽(yáng)離子柱和親水親酯柱等。

SPE柱要根據(jù)被測(cè)藥物的性質(zhì)和種類進(jìn)行選擇，通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)行篩選。Dorival G N等[10]對(duì)牛奶中經(jīng)常存在的14種β內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析，樣品經(jīng)乙腈/甲醇/Mc Ilvaine緩沖液(V/V/V:60/25/15)提取后再進(jìn)行PSA固相萃取柱凈化操作，隨后在高精度儀器的輔助下進(jìn)行檢測(cè)。該法中β內(nèi)酰胺類藥物定量限低至0.3 μg/kg～2.0 μg/kg，回收率高達(dá)96.0%～104.5%。王宏偉等[11]在測(cè)定牛奶中14種β內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測(cè)中，用乙腈進(jìn)行樣品提取后，經(jīng)預(yù)處理的HLB柱凈化后，用乙腈洗脫，平均回收率為70%～110%。孫濤等[12]建立了檢測(cè)生鮮乳中14種β內(nèi)酰胺類抗生素的SPE-UPLC-MS/MS方法，方法回收率為70.1%～95.5%，檢出限為0.1 μg/kg ～0.6 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg～1.8 μg/kg，應(yīng)用Oaiss Prime HLB固相萃取柱，無(wú)需活化、淋洗和洗脫的步驟，直接過(guò)濾凈化，大大提高了樣品前處理的速度。

固相萃取過(guò)程中，對(duì)有機(jī)溶劑的用量要求不高，也不容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，因此這種方式可以更好、更容易的進(jìn)行定量萃取來(lái)自乳制品中β內(nèi)酰胺類抗生素的痕量殘留。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)固相萃取技術(shù)的研究上有了長(zhǎng)足的發(fā)展，其中微萃取技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。這種方法用萃取相間與待測(cè)液體的非均相平衡關(guān)系，使待測(cè)組分?jǐn)U散吸附到石英纖維外部的涂層，進(jìn)行進(jìn)一步的儀器分析。這種方法相比SPE，它可以完成更大的萃取面積和固定薄膜，實(shí)現(xiàn)更好的聚集作用。Yahaya N等[13]用HPLC方法和固相微萃取技術(shù)對(duì)牛奶中3種不同的青霉素藥物進(jìn)行分析，以一種有序介孔碳COU-2為吸附劑，同時(shí)在萃取過(guò)程中對(duì)溶液的鹽加入量、pH、萃取時(shí)間、解析時(shí)間、洗脫溶劑和吸附劑量等影響因素進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，將試驗(yàn)的的回收率提高到80.3%～99.5%，定量限可達(dá)2.0 μg/L～3.3 μg/L。

1.2.3 基質(zhì)固相分散技術(shù) 基質(zhì)固相分散技術(shù)的預(yù)處理是將適量的填料與基質(zhì)進(jìn)行混合研磨，使得樣品與填料表面可以充分的接觸，得到半同態(tài)的混合物并將其作為填料裝柱，然后采用不同的溶劑淋洗、洗脫柱子，富集待測(cè)物。為了達(dá)到最優(yōu)萃取結(jié)果，需要對(duì)分散劑種類、樣品與分散劑比例及洗脫劑等進(jìn)行優(yōu)化[14]。王煉等[15]用MSPD方法先對(duì)牛奶樣品進(jìn)行了凈化，然后使用HPLC-MS/MS方法對(duì)牛奶中的20多種殘留藥物(含4種頭孢類藥物)進(jìn)行分析。在試驗(yàn)中，將2g C18與樣品進(jìn)行充分的研磨后，進(jìn)行裝柱，用甲醇溶劑進(jìn)行洗脫，回收率在71.2%～95.3%之間。這樣的處理方法，效率更高，測(cè)試便捷，但是相比于其他的萃取方法來(lái)說(shuō)，這種萃取方式效率偏低。

1.2.4 分子印跡技術(shù) 分子印跡技術(shù)是用待測(cè)物體為分子模板，采用非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵結(jié)合的聚合物單體進(jìn)行交聯(lián)，然后將模板分子從聚合物中提取出來(lái)，聚合物內(nèi)部就留下了模板分子的印跡，可以選擇性地提高待測(cè)物在高分子材料上的吸附性。王萍等[16]選擇分子印跡聚合物為固相萃取柱填料對(duì)牛奶中的3種青霉素類藥物進(jìn)行回收試驗(yàn)，提取后的液體，經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)分子印跡技術(shù)的回收率為83.5%～87.3%。這個(gè)凈化方法在預(yù)定、識(shí)別、實(shí)用等方面有很大優(yōu)勢(shì)，但是由于較難得到分離介質(zhì)要求的分離純品或價(jià)格昂貴而增加了試驗(yàn)的成本。

除此之外，張秀堯等[17]使用超濾離心法，先用乙腈對(duì)牛奶中β內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行提取，提取液經(jīng)超濾管離心凈化處理，通過(guò)超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜快速測(cè)定牛奶中53種β內(nèi)酰胺類抗生素及其代謝產(chǎn)物的殘留量。相關(guān)系數(shù)均高于0.991 1，平均加標(biāo)回收率在71%～121%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～19%。因此這種方法的操作非常簡(jiǎn)單、便捷，大大節(jié)省了前處理時(shí)間，且回收效果好，但由于其試驗(yàn)成本依然較高，不利于大范圍推廣。

2 牛奶中β內(nèi)酰胺類藥物殘留檢測(cè)方法

2.1 液相色譜法及液質(zhì)聯(lián)用法

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)是在經(jīng)典色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，在高壓下的流動(dòng)過(guò)程獲得的色譜過(guò)程，可以實(shí)現(xiàn)好的選擇性分離、高效分離，具備檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。許娜等[18]應(yīng)用HPLC-UV方法在進(jìn)行樣品的有機(jī)濾膜凈化后，用1 mL/L甲酸溶液和甲醇溶液進(jìn)行等濃度洗脫，得到的液體，通過(guò)254 nm波長(zhǎng)的色譜分析，回收率達(dá)90%～105%，檢出限為1.0 μg/L。多數(shù)的β內(nèi)酰胺類抗生素由于缺乏特征性的紫外吸收性質(zhì)，一般采用的DAD、UVD、FLD等檢測(cè)方法需進(jìn)行衍生化處理。但這種方法增加了測(cè)樣的難度，約束了對(duì)樣品處理方法的進(jìn)一步改進(jìn)。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography with mass spectrometry，LC-MS )技術(shù)同時(shí)具備液相色譜卓越的分離能力與質(zhì)譜可靠的定性信息，LC-MS技術(shù)已逐漸從單級(jí)質(zhì)譜發(fā)展到串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)。Baeza A N等[19]建立了牛奶中頭孢菌素類藥物的LC-MS/MS檢測(cè)方法，方法的定量限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥物最高殘留限量。

隨著近年來(lái)HPLC的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了超高效液相色譜技術(shù)(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，UPLC與MS/MS的聯(lián)用使得生物組織中β內(nèi)酰胺類藥物多殘留的檢測(cè)在種類和數(shù)量上有了進(jìn)一步的發(fā)展。李琴等[7]用UPLC-MS/MS法檢測(cè)牛奶中45種β內(nèi)酰胺類抗生素，以1 mL/L甲酸水(含100 mL/L甲醇)/乙腈(含100 mL/L甲醇)為流動(dòng)相，所有藥物選用ESI+進(jìn)行檢測(cè)，回收率為62.1%～118%。Junza A等[20]建立了同時(shí)測(cè)定牛奶中β內(nèi)酰胺類及喹諾酮類獸藥殘留的UPLC-MS/MS方法，該方法檢出限低至4.1 μg/kg～104.8 μg/kg，定量限達(dá)4.2 μg/kg～109.7 μg/kg，檢測(cè)方法令人滿意。隨著UPLC的使用，色譜的分離能力和藥物的分析速度有了極大的提高，而通過(guò)與UPLC等眾多分離技術(shù)的聯(lián)用，MS/MS檢測(cè)器已具有高通量的分析能力，能夠提供檢測(cè)物詳細(xì)的分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息，使得UPLC-MS/MS法在化學(xué)品的定性和定量檢測(cè)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其快速、高靈敏度及高精確的檢測(cè)特性使得近年來(lái)其在藥物分析、食品檢測(cè)等領(lǐng)域中發(fā)展迅速。

2.2 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)或稱為高效毛細(xì)管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)，是用高壓電磁場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)毛細(xì)管分離管道，根據(jù)樣品的電泳強(qiáng)度和分配差異實(shí)現(xiàn)液相分離的一種技術(shù)。左艷麗[21]用上述方法對(duì)頭孢菌素等抗生素進(jìn)行檢測(cè)，并建立了毛細(xì)管帶電泳法同時(shí)測(cè)定頭孢曲松鈉和左氧氟沙星含量的檢測(cè)方法，平均回收率為99.15%。但該方法由于電滲流不穩(wěn)定的原因，導(dǎo)致了結(jié)果重現(xiàn)性差的問(wèn)題，因此也限制了其在殘留分析的應(yīng)用。

2.3 免疫分析法

免疫分析法是用抗原、抗體的特異性識(shí)別及結(jié)合反應(yīng)的原理建立起的進(jìn)行樣品檢測(cè)的物質(zhì)分析方式，這種方法檢測(cè)效率高、檢測(cè)靈敏、操作簡(jiǎn)單，在β內(nèi)酰胺類藥物的檢測(cè)中進(jìn)行批量快速檢測(cè)或是現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)較為合適。β內(nèi)酰胺類藥物的免疫分析法主要包括了放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)等。Broto M等[22]用了酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)牛奶進(jìn)行青霉素類藥物殘留檢測(cè)分析，這種方法的檢出限為0.1 μg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥物的最高殘留限量。但是免疫分析法也存在著一些缺點(diǎn)，如檢測(cè)結(jié)果受雜質(zhì)影響存在著假陽(yáng)或假陰的情況。同時(shí)由于反應(yīng)的特異性，一次試驗(yàn)只能檢測(cè)一種藥物，這需要制備多種抗體，又大大增加了技術(shù)成本。

2.4 微生物檢測(cè)法

微生物檢測(cè)法(microbial inhibition test，MIT)也就是俗稱的微生物抑制性試驗(yàn)，是一種利用對(duì)微生物生理機(jī)能和代謝進(jìn)行抑制的作用來(lái)對(duì)藥物殘留進(jìn)行定性或定量的檢測(cè)方法[23]，包括紙片法、氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)法和試管擴(kuò)散法及四甲基偶氮唑鹽(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)法等。李延華等[24]用BSDA法、國(guó)標(biāo)TTC法和試管擴(kuò)散法對(duì)牛奶中β內(nèi)酰胺類藥物殘留的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比研究，BSDA法對(duì)6種β內(nèi)酰胺類藥物的檢測(cè)限均在歐盟規(guī)定的MRLs濃度范圍內(nèi)，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣；而TTC法對(duì)藥物的檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出歐盟規(guī)定的MRLs濃度范圍，不符合國(guó)際要求；試管擴(kuò)散法在檢測(cè)時(shí)間、操作難易程度方面較BSDA法及TTC法具有一定的優(yōu)越性。該法簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)省時(shí)同時(shí)檢測(cè)限較低，可補(bǔ)充BSDA法及TTC法的不足，應(yīng)用于檢測(cè)牛奶中β內(nèi)酰胺類抗生素的殘留。

3 結(jié)語(yǔ)

β內(nèi)酰胺類藥物在牛奶中的殘留報(bào)道最多。前處理過(guò)程在樣品提取方面，有機(jī)試劑的應(yīng)用廣泛。在樣品凈化方面，固相萃取技術(shù)相較于液液萃取技術(shù)、基質(zhì)固相分散技術(shù)和分子印跡技術(shù)不僅更有效，而且更容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)、快速、定量萃取，應(yīng)用廣泛，具有廣闊的發(fā)展前景，超濾離心技術(shù)作為新興技術(shù)，較于固相萃取技術(shù)大大簡(jiǎn)化了操作步驟，節(jié)省了前處理時(shí)間，提高了工作效率，但由于其成本較高，大范圍推廣還較為困難。在檢測(cè)方法上，由于微生物法成本低、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，是乳制品工廠檢測(cè)抗生素殘留的主要篩選分析方法。LC-MS/MS能夠準(zhǔn)確提供更詳細(xì)的分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息，具有更高的選擇性和精確度，已成為檢測(cè)牛奶中痕量β內(nèi)酰胺類藥物殘留的首選確證方法，應(yīng)用廣泛。目前由于β內(nèi)酰胺酶[25]的濫用及體內(nèi)代謝等原因，導(dǎo)致原形藥物發(fā)生酶解，影響了對(duì)原形藥物的檢測(cè)，現(xiàn)已有許多研究者開(kāi)展了關(guān)于頭孢類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝物解析的工作，但目前關(guān)于牛奶中多種β內(nèi)酰胺類藥物及其代謝物殘留同時(shí)檢測(cè)的報(bào)道仍然較少[26-27]。為以后能更有效地監(jiān)管牛奶中β內(nèi)酰胺類藥物的殘留，研究者應(yīng)致力于盡快建立起對(duì)原形藥物及其相應(yīng)代謝物的快速檢測(cè)技術(shù)。