王鳳花 張振國 賈 文

（2 土肥資源高效利用國家工程實驗室，泰安 271018）

（3 山東省高校農(nóng)業(yè)環(huán) 境重點實驗室，泰安 271018）

（4 大連 民族 大學經(jīng)濟管 理學院，大連 116650）

三氯生（Triclosan，TCS）是一種廣譜抗菌劑，作為一種典型的藥品和個人護理品（Pharmaceuticals and personal care products，PPCPs）廣泛用于洗發(fā)精、肥皂、洗衣液和牙膏等，應用量巨大［1］。這些日用品使用后經(jīng)生活污水進入城市污水處理廠，由于低的溶解度（1.97～4.6 mg L-1，25 oC）和高的疏水性（logKow= 4.76,pKa=8.14），TCS會吸附進入城市污泥，隨著污泥農(nóng)用不斷進入土壤，因此，土壤環(huán)境可能是該物質重要的匯［2-3］。土壤TCS濃度為0.052～1.0 mg kg-1干重［4］, 模擬預測濃度可達4.5 mg kg-1干重［5］。盡管濃度低，但TCS易在環(huán)境中累積，具有一定持久性［6］。TCS 的存在增加了土壤微生物對抗生素的抗性［7］。砂土中5 mg kg-1、黏土中50 mg kg-1的TCS降低了微生物硝化速率［8-9］，低于 10 mg kg-1的TCS抑制了土壤呼吸［9-10］。土壤中廣泛存在的TCS及其持久性使得其生態(tài)效應受到高度關注，成為近年來土壤環(huán)境領域關注的熱點［11］。

鎘（Cd）是毒性極大的重金屬，已被認定為人類致癌物［12］，通過污水灌溉、化肥和農(nóng)藥使用、畜禽糞便及其堆肥長期施用以及電子廢棄物堆棄等渠道進入土壤，Cd的污染在中國是非常嚴重和普遍的問題［13］。對中國礦區(qū)、工業(yè)區(qū)、公路旁、城市邊緣區(qū)、城市、污罐區(qū)、農(nóng)田、菜地、茶園、果園、森林等土壤重金屬含量調查結果顯示，土壤Cd的濃度為0～578 mg kg-1，平均值為3.52 mg kg-1，2 253個采樣點有547個點Cd含量超過了1.0 mg kg-1，93個點超過了10 mg kg-1［14-16］。因此，Cd在土壤中的生態(tài)風險一直受到廣泛關注［17-18］。

目前，土壤污染呈現(xiàn)由單一污染到復合污染的態(tài)勢。TCS的大量廣泛使用以及中水灌溉和活性污泥農(nóng)用導致其源源不斷地進入土壤中［2］?；钚晕勰嘀羞€含有許多重金屬，包括Cd［19］，因此，活性污泥中同時存在著TCS與Cd。Cd還通過上述途徑進入土壤導致Cd污染［13］。因此，土壤環(huán)境中存在著TCS與Cd復合污染的可能性。由于TCS和Cd均對土壤環(huán)境產(chǎn)生了不利影響，兩者的復合污染可能會降低土壤質量。而目前關于TCS與Cd復合污染土壤的生態(tài)效應信息尚缺乏，因此，非常有必要探討TCS與Cd的復合污染對土壤的健康效應。

土壤呼吸是土壤全部代謝過程的總和，被認為是土壤微生物總活性的指標，成為土壤污染評價的常用指標之一［20］。土壤蔗糖酶催化水解蔗糖轉變?yōu)槠咸烟呛凸?，為微生物提供能量，在土壤碳循環(huán)方面非常重要［21］。作為一種氮代謝酶，蛋白酶在氮素循環(huán)和調控植物利用氮方面發(fā)揮十分重要的作用。此外，上述三種指標對Cd的污染均較敏感［22］，如土壤呼吸與Cd含量尤其是Ca(NO3)2提取態(tài)Cd含量呈顯著負相關［23］，外源Cd含量也可能增強土壤呼吸活性［24］。酸性土壤Cd含量由2.5 mg kg-1增加至5 mg kg-1時，蔗糖酶活性降低了［25］。前人已經(jīng)對TCS與Cd單一脅迫的土壤呼吸效應進行了研究，而TCS與Cd復合污染的生態(tài)效應研 究還很匱乏。因此，本文以TCS和Cd為目標污染物，選擇土壤呼吸、蔗糖酶和蛋白酶為指標，通過室內模擬試驗研究兩者單一和復合污染對上述3 種指標的影響，試圖揭示土壤微生物活性和涉及碳、氮循環(huán)的酶活性對TCS和Cd單一及復合污染的響應規(guī)律，為評價此 類新型復合污染的環(huán)境風險提供重要的科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　供試土壤

土壤樣品采自泰安市山東農(nóng)業(yè)大學南校區(qū)科技試驗田，采樣時間為2015年3月24日。除去土壤表面的雜草、枯葉后，采用五點法采集0～20 cm表層土。取回后，去除石礫和植物殘體等雜物，完全混合，室溫 下風干，過 2 mm篩，置于4℃冰箱 備用。土壤為棕壤，根據(jù)中國土壤系統(tǒng)分類命名為普通簡育濕潤淋溶土（Typic-Hapli-Udic Argosols）。土壤全氮、全磷和全鉀含量分別為0.73、7.38和1.54 g kg-1，堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別為132.3、18.4和125.7 mg kg-1，pH為7.6，有機質為17.6 g kg-1，黏粒（＜2 μm）、粉粒（50～2 μm）和砂粒（＞50 μm）含量分別為104、577和319 g kg-1。土壤中Cd含量為2.22 mg kg-1。

1.2　供試藥劑

TCS標準品（純度99.5%）購自Sigma-Aldrich（美國），溶于丙酮，配成5 g L-1儲備液，置于4℃冰箱保存；Cd為分析純氯化鎘（CdCl2），其他試劑均為分析純。

1.3　試驗設計

將上述處理好的土樣從冰箱中取出，置于25℃培養(yǎng)箱中避光預培養(yǎng)3 d。稱取預培養(yǎng)好的土壤樣品200g，向土樣分別加入稀釋至不同濃度的TCS和Cd溶液，充分混勻。為避免溶劑的不利 影響，將土壤樣品置于通風櫥中2 h至丙酮溶劑揮發(fā)完全后繼續(xù)充分攪拌混勻。參考TCS 與Cd的土壤微生態(tài)效應文獻［12，24-26］，土樣中TCS最終濃度分別為0、1.0、10.0、50.0 mg kg-1干土，Cd的最終濃度為0、10.0 mg kg-1干土，復合污染處理組濃度（TCS/Cd）為1.0/ 10.0,10.0/10.0,50.0/10.0 mg kg-1干土。調節(jié)土壤含 水量為最大持水量的60%，置于培養(yǎng)箱中，25℃避光培養(yǎng)，每2～3天補充水分，使土樣含水量在整個實驗期間保持恒定。培養(yǎng)后第7、14、28和56天分別取土樣測定土壤呼吸強度、蛋白酶和蔗糖酶活性，每處理設3個重復。

1.4　測定方法

土壤呼吸采用室內密閉培養(yǎng)法［27］測定。蔗糖酶活性采用0.1 mol L-1的Na2S2O3滴定法測定，以1 g土壤37℃下培養(yǎng)24 h后所消耗的0.1 mol L-1Na2S2O3毫升數(shù)表示［28］。蛋白酶活性采用比色法測定，以24 h 后1 g 干土中酪氨酸的質量表示，mg g-1d-1［28］。

1.5　數(shù)據(jù)分析

不同處理對土壤呼吸和酶活性的影響率用如下公式計算：式中，A為添加污染物時的土壤呼吸或酶活性；B為未添加污染物時的土壤呼吸或酶活性；正值表示刺激或激活，負值表示抑制。

計算TCS與Cd復合污染的作用模式是以概率為基礎［29］，該方程為：

式中，P(E)為抑制率理論預測值；PA為污染物A引起的抑制率；PB為污染物B引起的抑制率；假設P(T)為抑制率實際測定值。將P(T)與P(E)進行差異顯著性分析，零假設是P(T)高于P(E)，若有顯著性差異則聯(lián)合作用模式是協(xié)同作用；若P(T)低于P(E)且有顯著性差異，則聯(lián)合作用模式是拮抗作用；若P(T)與P(E)間無顯著性差異，則聯(lián)合作用模式是加和效應。

所有測定數(shù)據(jù)均用 Microsoft Excel 2007和SPSS17.0進行計算和統(tǒng)計分析，以平均值±標準差的形式表示。

2　結 果

2.1　三氯生與鎘單一及復合污染對土壤呼吸的影響

TCS與Cd單一及復合污染對土壤呼吸影響的變化趨勢如圖1所示。兩者單一和復合脅迫下土壤呼吸活性均呈現(xiàn)先上升接著下降最后又上升的變化趨勢（圖1）。Cd（10.0 mg kg-1）單一脅迫時，培養(yǎng)7d對土壤呼吸有明顯的激活作用，激活率達18.52%，但14 d和28 d時轉為抑制作用，抑制率達10.12%和10.78%，56 d時又轉為激活作用，激活率為24.16%（圖1A），與對照相比有顯著差異（p＜0.05），表明10.0 mg kg-1的Cd僅是短暫抑制了土壤呼吸作用。TCS單一脅迫培養(yǎng)前期（7 d）對土壤呼吸表現(xiàn)為激活作用，不同濃度TCS的激活率分別為25.26%，27.98%和18.45%；隨著培養(yǎng)時間延長，14 d和28 d時，土壤呼吸均被抑制；但56 d時，土壤呼吸又被顯著激活，激活率分別為41.84%、31.56%和21.41% (TCS1.0、TCS 10.0和TCS 50 mg kg-1) （圖1B），與TCS添加濃度顯著相關（p＜0.05）。不同濃度的TCS與Cd復合脅迫第7天時刺激了土壤呼吸活性，隨著TCS濃度增加，激活作用減弱；14 d和28 d時抑制了土壤呼吸，隨著TCS濃度增加，抑制作用也隨之減弱；實驗最后（56 d）又轉為非常明顯的刺激作用（圖1C）。

2.2　三氯生與鎘單一及復合污染對土壤蛋白酶的影響

TCS與Cd單一及復合污染對土壤蛋白酶活性的影響如圖2所示。Cd單一脅迫在整個實驗期間對土壤蛋白酶活性均有明顯的刺激作用，激活率在前14 d無明顯變化，28 d時顯著 降低，但56 d時顯著增加，達到最大值（94.5%）（圖2A）。不同濃度的TCS單一脅迫均刺激了蛋白酶活性，激活程度隨培養(yǎng)時間及濃度水平的變化而變化；56 d時激活效應最強，1.0、10.0和50.0 mg kg-1濃度下分別達到31.8%、42.1%和68.2%，且與TCS添加濃度呈顯著正相關（p＜0.05）（圖2B），表明高濃度TCS強烈刺激了土壤蛋白酶活性。TCS與Cd復合脅迫仍對蛋白酶活性表現(xiàn)強烈的刺激作用，隨著培養(yǎng)時間延長，激活率先降低后升高，56 d時達到最大，TCS/Cd 1.0/10.0、TCS/Cd 10.0/10.0和TCS/Cd 50.0/10.0mg kg-1時，激活率分別為98.0%、110.3%和102.7%（圖2C），但同一時間不同濃度的激活程度無顯著性差異（p＞0.05）。Cd的激活作用大于不同濃度（1.0、10.0和50.0 mg kg-1）TCS的效果，表明Cd在兩者的復合污染中起主要作用。

圖1　三氯生與鎘單一及復合污染對土壤呼吸的影響率Fig. 1 Influence ra tio of single-factor and combined pollution of triclosan and cadmium on soil respiration

圖2　三氯生與鎘單一及復合污染對土壤蛋白酶活性的影響率Fig. 2 Influence ratio of single-factor and combined pollution of triclosan and cadmium on soil protease

2.3　三氯生與鎘單一及復合污染對土壤蔗糖酶的影響

TCS與Cd單一及復合污染對蔗糖酶活性的影響如圖3所示。10.0 mg kg-1Cd單一脅迫下，蔗糖酶活性均被顯著抑制，14 d時抑制率達到最大值（81%），但不同培養(yǎng)時間的抑制率之間無顯著差異（p＞0.05）（圖3A）。TCS單一脅迫也顯著降低了蔗糖酶活性，抑制率隨培養(yǎng)時間和濃度的變化而變化（圖3B）：同一污染濃度下，隨培養(yǎng)時間的變化，56 d時各濃度的抑制率最小；相同培養(yǎng)時間時，TCS濃度越高抑制效應越強，50.0 mg kg-1TCS在7 d、14 d、28 d和56 d的抑制率分別為58.34%、43.81%、62.86%和20.01%。TCS與Cd的復合污染脅迫在整個實驗期間同樣顯著抑制了蔗糖酶活性，但抑制程度隨培養(yǎng)時間的延長和濃度水平的不同變化不明顯（圖3C）：TCS/Cd 1.0/10.0 mg kg-1時 ，抑制率為82.9%～89.6%，TCS/Cd 10.0/10.0 mg kg-1和TCS/Cd 50.0/10 .0 mg kg-1時抑制率稍有降低，分別為70. 7%～82.1%和71.6%～83.9%。整個實驗期間Cd和TCS的復合污染對蔗糖酶的聯(lián)合效應與Cd單一污染相比無顯著差異（p＞0.05），表明TCS和Cd復合作用下Cd的毒性效應起決定作用。

圖3　三氯生與鎘單一及復合污染對土壤蔗糖酶活性的影響率Fig. 3 Influence ratio of single-factor and combined pollution of triclosan and cadmium on soil inverase

2.4　三氯生與鎘復合污染的聯(lián)合效應

如圖4所示，不同濃度TCS和Cd 復合污染對土壤呼吸的聯(lián)合效應中，7 d時P (E)大于P (T)，且差異均顯著，表明兩者的復合污染表現(xiàn)為拮抗作用，其聯(lián)合效應不隨濃度的改變而改變。14 d和28 d時，復合污染聯(lián)合效應中P (E)小于P (T)，除了TCS/Cd1.0/10.0時差異不顯著表現(xiàn)為加和作用外，其余結果差異均顯著，因此表現(xiàn)為協(xié)同作用。56 d時僅有TCS/Cd1.0/10.0的聯(lián)合效應表現(xiàn)為明顯的拮抗作用，其他兩種劑量下均為加和作用。因此，TCS與Cd復合污染對土壤呼吸的聯(lián)合效應作用模式隨著培養(yǎng)時間的變化而變化（圖4A）。

圖4　三氯生與鎘復合污染對土壤呼吸（A）、蛋白酶（B）和蔗糖酶（C）影響率的理論值與實測值比較Fig. 4 Comparison of theoretically predicted value with observed value of combined effects of TCS and Cd on soil respiration (A),protease (B) and invertase (C)

TCS與Cd復合污染對蛋白酶的聯(lián)合效應中，培養(yǎng)7 d時P（E）小于P（T），且差異性顯著，均表現(xiàn)為協(xié)同作用。隨著培養(yǎng)時間延長，僅有50.0 mg kg-1TCS和Cd 復合污染在14 d時以及10.0 mg kg-1TCS和Cd 復合污染在56 d時P（E）與P（T）差異顯著，分別表現(xiàn)為拮抗和協(xié)同作用，其他濃度和時間的復合污染P（E）與P（T）差異不顯著，表現(xiàn)為加和效應。因此，TCS與Cd復合污染對土壤蛋白酶的聯(lián)合毒性效應作用模式隨污染物濃度和培養(yǎng)時間的變化而變化（圖4B）。

TCS與Cd復合污染對土壤蔗糖酶的聯(lián)合毒性效應中，僅有1.0 mg kg-1TCS和Cd復合污染在14 d、28 d和56 d時P（E）與P（T）差異不顯著，表現(xiàn)為加和作用，其他濃度和培養(yǎng)時間均表現(xiàn)為協(xié)同作用。因此，TCS與Cd復合污染對蔗糖酶的聯(lián)合效應以協(xié)同作用為主（圖4C）。

3　討 論

本研究中Cd單一脅迫7 d土壤呼吸 增加，這與Lu等［24］的結果相同，這是因為實驗培養(yǎng)7 d時土壤可利用碳較多，Cd脅迫下微生物需要更多的能量生存，因此，僅有少部分碳被吸收而大部分碳被消耗為CO2導致土壤呼吸增加。隨后土壤呼吸下降，這與Usman［30］的結果一致，隨著培養(yǎng)時間延長，土壤可利用碳量下降，同時，一部分微生物在Cd的毒性下被抑制或殺滅，因此，培養(yǎng)至中間時土壤呼吸持續(xù)下降；而培養(yǎng)結束時土壤呼吸再被激活，可能是因為微生物在Cd脅迫下通過適應和變異產(chǎn)生耐性菌種，該菌種對土壤呼吸促進作用大于Cd對其他微生物呼吸的抑制作用，導致土壤整體呼吸強度升高；另一方面，被殺滅微生物的分解也會增加土壤呼吸［31］。TCS對土壤呼吸的影響已有部分研究，Waller和Kookana［9］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度（1.0 mg kg-1）TCS對土壤呼吸無顯著影響，中濃度（10.0 mg kg-1）TCS僅在砂土中激活了土壤呼吸，高濃度（50.0 mg kg-1）TCS僅在黏土中抑制了土壤呼吸。Butler等［10］的研究同樣得到不同類型土壤（壤砂土、黏土和砂壤土）中TCS對土壤呼吸的影響差異較大：施用之初土壤呼吸在壤砂土中被顯著抑制，隨著濃度增加，抑制作用增強，但在黏土和砂壤土中10.0 mg kg-1TCS對土壤呼吸無顯著抑制作用，其他濃度的TCS明顯抑制了土壤呼吸。因此，土壤類型顯著影響TCS對土壤呼吸的脅迫效應，如pH、黏粒含量和有機質在土壤呼吸變化中分別起到1%、16%和15%的貢獻［10］。本研究所用的土壤與上述土壤性質有明顯差異，導致TCS的生物有效性明顯不同，因此，研究結果有較大差異。此外，TCS既可作為微生物的碳源，同時又對微生物具有毒性作用［10］。本研究土壤呼吸在前期被激活，中期被抑制，56 d時又被激活，原因可能是培養(yǎng)7 d時TCS被微生物作為碳源加以利用，刺激了微生物活性，而未利用的TCS對微生物產(chǎn)生毒性作用從而導致了隨后的抑制效應，56 d后TCS被部分降解，毒性降低，大部分微生物適應了TCS脅迫之后能夠利用其作為碳源和能源生長，從而增強呼吸作用。本研究復合污染對土壤呼吸的影響趨勢與TCS和Cd單一污染時的作用均遵循“激活—抑制—激活”規(guī)律，這與芘、Cd單一及復合污染脅迫下土壤呼吸先下降后上升的污染擴散模式［32］相似。

蛋白酶參與土壤氨基酸、蛋白質以及其他含蛋白質氮有機化合物的轉化，是與氮循環(huán)密切相關的重要胞外酶，因此，探討污染物對土壤蛋白酶活性的生態(tài)效應非常必要。本實驗Cd脅迫促進了蛋白酶活性增加，表明對Cd產(chǎn)生耐性的微生物生長較快，其對蛋白酶的促進作用大于Cd對蛋白酶的抑制作用，整體提高了酶活性。因此，Cd 污染土壤中可以富集培養(yǎng)并篩選分離出耐性菌屬，馴化培養(yǎng)后用于污染土壤的微生物修復［32］。不同濃度TCS單一脅迫均刺激了蛋白酶活性，可能是因為盡管TCS具有廣譜的殺菌活性，但在0～50 mg kg-1時顯示出抑菌活性，在高濃度下才表現(xiàn)出殺菌活性。抑菌活性下的TCS仍可被耐性的微生物作為碳源和能源，促進了蛋白酶活性增加［11］。TCS與Cd復合污染作用下，重金屬的存在抑制了TCS的降解［33］，TCS與重金屬的復合污染表現(xiàn)出協(xié)同作用，即增強了TCS或Cd單一污染下的激活效應；且TCS與銅的復合污染增強了微生物的代謝活性，尤其是氮代謝作用，因此可能在一定程度上增強了蛋白酶的活性［11］。

蔗糖酶參與土壤碳素循環(huán)，是土壤中研究最多的酶之一。Cd單一脅迫下，蔗糖酶活性均被顯著抑制。原因可能是Cd 脅迫引起酶分子中的活性部位——巰基和含咪唑的配位結合，形成較穩(wěn)定的絡合物，產(chǎn)生了與底物的競爭性抑制，最終導致酶活性下降［34］。TCS單一脅迫時，蔗糖酶活性也被顯著抑制，是由于TCS具有廣譜抗菌活性，通過模擬烯酰還原酶的天然基質影響微生物脂肪酸合成路徑，導致對酶的不可逆抑制［35］。TCS與Cd復合污染抑制了土壤蔗糖酶活性，這與TCS與銅或鋅復合污染降低了硫酸酯酶和磷酸酶活性結果相同，原因可能是TCS與Cd的復合污染起協(xié)同作用，削弱了土壤碳素能量循環(huán)和營養(yǎng)周轉率，影響了蔗糖酶活性。本研究表明，蔗糖酶活性對TCS與Cd單一及復合污染的敏感性最高，可作為兩者復合污染的生態(tài)評價指標之一。

盡管TCS單一污染的生態(tài)效應研究較多，但對TCS與重金屬復合污染的土壤生態(tài)效應信息了解較少。復合污染的作用類型有協(xié)同、加和和拮抗三種，基于不同的作用方式預測復合脅迫類型的模型有多個［36］，本研究利用的模型基于這樣的假設：污染物對生物體是同時起作用的。TCS和Cd復合污染總體上以協(xié)同效應為主，可能是因為重金屬的存在抑制了TCS降解，使得兩者的共存時間增加，兩者經(jīng)過6個月的復合作用對土壤酶活性仍具有協(xié)同效應［33］。復合污染的聯(lián)合毒性效應隨著TCS濃度變化而發(fā)生顯著變化，這是因為TCS作為抗菌劑在低濃度時具有抑菌活性，高濃度時才具有殺菌活性，因此，不同濃度下與Cd的復合脅迫效應不同。此外，TCS易吸附在土壤有機質中使其生物有效性下降［37］，因此，TCS和Cd復合污染的聯(lián)合效應隨著培養(yǎng)時間的變化也發(fā)生顯著變化。

目前，土壤環(huán)境面臨的一個重要問題是抗菌劑或抗生素的過量使用導致耐藥細菌的產(chǎn)生［2］。研究表明，暴露在TCS中的土壤微生物會通過各種機制發(fā)展對TCS或其他藥物的抗性［38］。TCS單一或與Cd復合脅迫下土壤呼吸先被抑制后被激活了，表明部分存活的微生物群落發(fā)展了抗性。但在對土壤蛋白酶和蔗糖酶的生態(tài)效應中，整個實驗期間均被激活或抑制了，表明仍有部分微生物未表現(xiàn)對TCS的抗性，即50 mg kg-1的TCS并未對微生物產(chǎn)生明顯的選擇性壓力而導致敏感微生物被耐受微生物替代，且Cd的脅迫也未增加微生物對TCS的抗性。但是，不同土壤中TCS與銅/鋅的復合脅迫下微生物對TCS的抗性表現(xiàn)差異很大［11］，因此，不同濃度TCS單一或與Cd復合污染下微生物的抗性需要深入研究。

4　結 論

三氯生與Cd單一及復合污染對土壤呼吸呈現(xiàn)激活—抑制—激活的生態(tài)效應；刺激了蛋白酶活性， 激活率先降低后升高，56 d時達到最大；整個實驗期間均 抑制了蔗糖酶活性，Cd單一污染培養(yǎng)14 d抑制率達到最大值（81%），TCS單一脅迫呈現(xiàn)負的劑量效應關系，兩者復合污染無顯著的劑量效應關系。聯(lián)合效應評價模型預測表明，相比TCS或Cd單一污染，兩者的復合脅 迫對土壤呼吸呈現(xiàn)隨時間變化的拮抗—協(xié)同—加和效應，對土壤蛋白酶呈 現(xiàn)協(xié)同—加和—協(xié)同的聯(lián)合效應，而對土壤蔗糖酶活性則主要為協(xié)同效應。聯(lián)合效應隨著TCS濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長而加劇或降低。

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