趙偉燁 王智慧 曹彥強(qiáng) 劉天琳 羅紅燕 朱 波 蔣先軍?

（1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715）

（2 中國(guó)科學(xué)院成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所，成都 610041）

氮（N）素是地球所有生物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素［1］。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中大量氮肥的投入雖然增加了作物的產(chǎn)量，但也引起了水體污染及溫室氣體排放等環(huán)境問(wèn)題［2］。硝化作用作為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮素?fù)p失的主要途徑之一，是氨經(jīng)過(guò)亞硝酸鹽最終轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的氧化過(guò)程，由氨氧化和亞硝酸氧化兩步組成，分別由氨氧化細(xì)菌（Ammoniao x i d i z i n g b a c t e r i a,A O B）、氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea, AOA）和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌 （Nitrite-oxidizing bacteria, NOB）驅(qū)動(dòng)完成［3］。由于氨氧化是硝化作用的限速步驟［4］，同時(shí)NOB相比于AOB和AOA更難在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中生長(zhǎng)［5］，因此多年來(lái)人們研究的方向主要集中在氨氧化微生物上，對(duì)AOB和AOA在生態(tài)系統(tǒng)中的分布［6-8］、在土壤硝化作用中 的相對(duì)貢獻(xiàn)［9］、影響因子［10-11］以及不同氮源下氨氧化微生物的群落組成變化［12］等進(jìn)行了大量深入研究。NOB利用亞硝酸鹽氧化酶將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽，亞硝酸鹽是其唯一氮源［13］。亞硝酸鹽作為硝化作用的中間產(chǎn)物，能夠通過(guò)氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌之間的緊密配合立刻轉(zhuǎn)化為硝酸鹽［14］，然而，有時(shí)氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌不同的生長(zhǎng)速率會(huì)打破這種合作機(jī)制導(dǎo)致亞硝酸鹽的累積［15］。研究發(fā)現(xiàn)［16］，溫度、pH、溶解氧等因子對(duì)NOB活性具有顯著影響，也會(huì)導(dǎo)致亞硝酸鹽的累積。最近，科學(xué)家們報(bào)道了一種單步硝化螺菌屬細(xì)菌能夠執(zhí)行全程硝化（complete nitrification）過(guò)程［17-18］，即先前被人們認(rèn)知的僅僅能夠催化亞硝酸鹽氧化的亞硝酸鹽氧化細(xì)菌。全程氨氧化微生物（Comammox）的發(fā)現(xiàn)為土壤硝化作用的研究開創(chuàng)了全新的領(lǐng)域。

氮肥施入土壤后會(huì)導(dǎo)致土壤局部環(huán)境的變化［19］，在實(shí)際的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中，氮肥的施用也必然會(huì)導(dǎo)致其他離子進(jìn)入土壤，對(duì)土壤硝化作用產(chǎn)生影響［19］。石灰性紫色土主要發(fā)育在亞熱帶地區(qū)石灰性紫色砂頁(yè)巖，pH較高，土質(zhì)較為疏松，氮素含量較低。由于高pH土壤相比于低pH土壤硝化作用強(qiáng)，更容易造成氮素的損失，因此本文以石灰性紫色土為研究對(duì)象，采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)以表征石灰性紫色土在硫酸銨、氯化銨和尿素三種不同底物下的硝化作用強(qiáng)弱差異，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)分析AOB和AOAamoA基因拷貝數(shù)在培養(yǎng)過(guò)程中的變化并通過(guò)高通量測(cè)序分析石灰性紫色土加入不同底物后的物種進(jìn)化及硝化細(xì)菌群落組成。從微生物層面探究石灰性紫色土硝化作用發(fā)生機(jī)制，以期為合理施肥，提高氮素利用率提供資料。

1　材料與方法

1.1　供試土壤

供試土壤采自中國(guó)科學(xué)院成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所鹽亭紫色土農(nóng)業(yè)生態(tài)觀測(cè)研究站，東經(jīng)105°28′，北緯31°16′，年均氣溫17.4℃，年均降水826 mm，為亞熱帶季風(fēng)氣候。供試土樣為石灰性紫色土，種植作物為小麥。于2016年9月用土鉆按五點(diǎn)取樣法鉆取0～20 cm耕作層土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室后均勻混合，去除枯枝落葉等雜物后自然風(fēng)干，過(guò)2 mm篩儲(chǔ)存于4℃冰箱用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其余過(guò)1 mm篩用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定。供試土壤pH 8.33，有機(jī)質(zhì)15.62 g kg-1，全氮1.29 g kg-1，全磷0.81 g kg-1，全鉀17.63 g kg-1，速效氮71.91 mg kg-1。

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用室內(nèi)培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)前測(cè)定土壤含水量，根據(jù)土壤含水量稱取過(guò)2 mm篩的鮮土（以10.00 g干土計(jì)）置于150ml的玻璃廣口瓶。試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加不同氮源的4個(gè)處理，分別為CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2，各3個(gè)重復(fù)，所加氮源濃度均為 N 100 mg kg-1，通過(guò)均勻添加超純水調(diào)節(jié)土壤水分含量至田間持水量（WHC）的60%，用保鮮膜將瓶口封住，用針頭在保鮮膜上扎5～6個(gè)小孔，使廣口瓶處于通氣狀態(tài)，將廣口瓶置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，并在培養(yǎng)過(guò)程中每隔3 d以稱重法補(bǔ)充蒸發(fā)損失的水分以保持土樣的水分含量恒定。在培養(yǎng)的第0、14、28天進(jìn)行破壞性取樣，測(cè)定培養(yǎng)土樣的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮，同時(shí)將剩余土樣保存于-20℃用于AOA和AOBamoA基因拷貝數(shù)測(cè)定及高通量測(cè)序。

1.3　項(xiàng)目分析與測(cè)定

pH采用玻璃電極測(cè)定（1∶2.5的土水比）；有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀容量法測(cè)定；全氮用半微量凱氏法測(cè)定；全磷用鉬銻抗比色法測(cè)定；全鉀用火焰光度法測(cè)定；速效氮用堿水解法測(cè)定；銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用靛酚藍(lán)比色法和紫外分光光度法 測(cè)定［20］。

土壤DNA的提?。罕緦?shí)驗(yàn)采用FastDNA?SPIN Kit for soil（MP Biomedicals）試劑盒進(jìn)行，分別稱取0.5 g從-20 ℃冰箱去取出的土樣，按試劑盒操作步驟進(jìn)行，在Fsat PrepTMFP120核酸提取儀中以6 m s-1的速度裂解40 s，提取后的DNA在-20 ℃下保存，用于AOA和AOBamoA基因拷貝數(shù)的測(cè)定。

定量PCR分析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用大連寶生物工程有限公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒在CFX96 Optical Real-Time PCR System(Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA)擴(kuò)增儀上進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，包含模版 DNA、上下游引物和 Taq DNA聚合酶。AOBamoA基因片段(491bp)上下引物分別為amoA-1F和amoA-2R［21］，AOAamoA基因片段(635bp)上下引物分別為archamoAF和arch-amoAR［22］。

AOB和AOAamoA功能基因及16S rRNA基因-Miseq 測(cè)序：（1）目的基因的擴(kuò)增及純化。①將提取的DNA樣品分別用特異引物（amoA-1F和amoA-2R）、（arch-amoAF和arch-amoAR）及通用引物（515F和907R）進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，DNA 水平的 PCR 擴(kuò)增體系主要包括: 25 μL的SYBR@Premix EX TaqTM(TaKaRa 公司)，上下引物各1.0 μL，加入 1.0 μL的DNA 模板和20.5μL無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增條件均為：95℃，5 min；27 循環(huán)×（95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s）；72 ℃，10 min；保持 4 ℃，得到PCR產(chǎn)物。②獲得土壤DNA水平的基因擴(kuò)增產(chǎn)物后，將PCR 產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0 試劑盒（Takara)純化，純化產(chǎn)物溶解于25 μL DNase-free H2O。③純化后的PCR 產(chǎn)物通過(guò)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化效果，利用微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000 UV-Vis）測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度。（2）進(jìn)行Illumina PE250 文庫(kù)構(gòu)建，測(cè)序由上海美吉生物科技有限公司完成，amoA功能基因測(cè)序得到大于 1萬(wàn)條的測(cè)序數(shù)據(jù)量，16S rRNA基因測(cè)序得到 大于3萬(wàn)條的測(cè)序數(shù)據(jù)量。（3）數(shù)據(jù)處理：測(cè)序后提取出的數(shù)據(jù)以fastq 格式保存，數(shù)據(jù)每個(gè)樣本有 fq1 和 fq2兩個(gè)文件，里面為測(cè)序兩端的序列，序列按順序一一對(duì)應(yīng)。測(cè)序原始數(shù)據(jù)根據(jù)PE 序列之間的重疊關(guān)系，將成對(duì)的序列拼接，對(duì)序列中低質(zhì)量序列(＜50 bp)進(jìn)行剔除，據(jù)序列首尾兩端的條碼和引物序 列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。利用Usearch軟件按照＞97%進(jìn)行OTU聚類分析，進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，基于分類學(xué)信息，可以在各個(gè)分類水平進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

1.4　數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 18軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、AOB、AOAamoA基因拷貝數(shù)及AOB和NOB在屬水平上的百分比等在Excel中處理后采用Origin 8.1作圖，系統(tǒng)發(fā)育樹采用Mega 4.0等軟件完成。

2　結(jié) 果

2.1　土壤中NO3--N、NH4+-N含量的變化

土壤中NO3--N、NH4+-N在0 d和28 d的含量變化如圖1所示。CK、(NH4)2SO4、NH4C l和CO(NH2)2四種處理在0 d時(shí)的硝態(tài)氮含量分別為N 7.22、6.54、7.77和7.91 mg kg-1，經(jīng)過(guò)28 d培養(yǎng)后，土壤中硝態(tài)氮的累積量變?yōu)镹 31.40、115.2、101.3和122.5 mg kg-1，而銨態(tài)氮的變化由0 d時(shí)的N 5.91、95.95、95.86和93.98 mg kg-1減少為0.41、0.01、5.31和0.35 mg kg-1。與CK相比，(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2作為氮源加入后顯著促進(jìn)了硝態(tài)氮的累積（p＜0.05），由圖1看出，NH4Cl處理中硝態(tài)氮的累積量在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，硝態(tài)氮的累積量顯著低于(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理（p＜0.05），而銨態(tài)氮含量在28 d培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，除NH4Cl處理外，CK、(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理銨態(tài)氮含量均消耗殆盡，28 d結(jié)束時(shí)，NH4Cl處理中銨態(tài)氮的含量顯著高于其余處理（p＜0.05），與硝態(tài)氮含量變化相對(duì)應(yīng)。

圖1　土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量隨時(shí)間的變化Fig. 1 Variation of soil NO3- -N and NH4+-N contents with time

2.2　土壤氨氧化細(xì)菌（A O B）和氨氧化古菌（AOA）amoA基因拷貝數(shù)變化

AOB和AOAamoA基因拷貝數(shù)隨時(shí)間的變化如圖2所示。從圖2看出，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOBamoA基因拷貝數(shù)在培養(yǎng)過(guò)程中均呈顯著變化趨勢(shì)（p＜0.05），除NH4Cl處理外，CK、(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理中AOB豐度均呈現(xiàn)出先顯著增加后顯著降低的趨勢(shì)（p＜0.05）。(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理中AOB豐度在14 d時(shí)達(dá)到最大值，分別為3.38×107g-1干土和3.55×107g-1干土，到28 d減少至1.46×107g-1干土和1.69×107g-1干土，可能由于隨著底物濃度的消耗殆盡， AOB豐 度也隨之減少 。而NH4Cl處理中AOB豐度呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，從圖2看出，在14 d時(shí)，NH4Cl處理的土壤A OB豐度顯著低于(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理的土壤中AOB豐度（p＜0.05），而在28 d時(shí)，NH4Cl處理的土壤AOB豐度顯著高于(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理土壤中AOB的豐度（p＜0.05），可能由于NH4Cl處理延緩了銨態(tài)氮的消耗，在培養(yǎng)過(guò)程中可以持續(xù)為AOB提供充分底物。由圖2 明顯看出CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOAamoA基因拷貝數(shù)在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)顯著變化（p＞0.05）。

圖2　氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（ AOA）amoA基因拷貝數(shù)變化Fig. 2 Variation of number of amoA gene copies in ammonia oxidizing bacteria (AOB) and archaea（AOA）

2.3　土壤氨氧化細(xì) 菌（A O B）和氨氧化古菌（AOA）amoA功能基因系統(tǒng)進(jìn)化

AOB和AOAamoA功能基因系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3和圖4所示。對(duì)amoA功能基因進(jìn)行相似性分析，按照＞97%相似性進(jìn)行OTU分類。石灰性紫色土AOBamoA功能基因在0 d和28 d的測(cè)序結(jié)果分析分別得到7個(gè)和8個(gè)OTU，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下AOBamoA功能基因類群均屬于Cluster 3 。分析發(fā) 現(xiàn)OTU 1所含序列占比最大，且CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下的序列數(shù)占比由0 d時(shí)的14%、16%、15%和9%變?yōu)?8 d時(shí)的28%、79%、72%和76%，序列數(shù)顯著增加，且與Nitrosospirasp.Nsp2（AJ298719）有密切的親緣關(guān)系。而OTU 2 中CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下的序列數(shù)占比下降幅度較大，經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)與Nitrosolobusmultiformis（X90822）有密切的親緣關(guān)系。石灰石性紫色土AOAamoA功能基因在0 d和28 d的測(cè)序結(jié)果分析分別得到9個(gè)OTU，系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下AOAamoA功能基因類群Group 1.1b占主要，說(shuō)明石灰性紫色土中AOAamoA功能基因類群主要屬于Group 1.1b 。

圖3　石灰性紫色土AOB amoA功能基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of AOB amoA functional genes in the calcareous purple soil

圖4　石灰性紫色土AOA amoA功能基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of AOA amoA functional genes in the calcareous purple soil

2.4　硝化細(xì)菌群落組成

CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理在0 d時(shí)的樣本16S基因測(cè)序得到41 109、31 654、38 918和39 187條序列，28 d時(shí)的樣本16S基因測(cè)序得到36 212、33 822、32 807和40 295條序列。從所有序列挑出屬于AOB和NOB的序列，在屬水平上AOB和NOB序列占總序列的百分比如圖5所示。從圖5看出CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理在0 d時(shí)AOB分別占總序列的0.12%、0.08%、0.12%、0.13%，NOB分別占總序列的0.61%、0.58%、0 .60%、0.61%，經(jīng)過(guò)28 d培養(yǎng)過(guò)程，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOB分別占總序列的0.12%、0.28%、0.33%、0.20%，NOB分別占總序列的0.76%、1.14%、1.02%、1.26%，而且CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理下NOB占總序列的比例明顯高于AOB占總序列的比例。除CK外，添加氮源經(jīng)過(guò)28 d培養(yǎng)后，AOB和NOB占總序列的比例明顯增長(zhǎng)。(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理中，經(jīng)過(guò)28 d培養(yǎng)，AOB和NOB占比相比于0 d分別增加3.50倍、2.75倍、1.54倍和1.97倍、1.70倍、2.07倍。

圖5　AOB和NOB屬水平占總微生物的百分比Fig. 5 Percentages of AOB and NOB in total number of microorganisms at the genus level

圖6　AOB和NOB在每個(gè)cluster的相對(duì)豐度Fig. 6 Relative abundanceof AOB and NOB in each cluster

AOB和NOB在每個(gè)cluster的相對(duì)豐度如圖6所示，從中得出，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOB主要以Nitrosospira為主，NOB主要以Nitrospira為主。0 d時(shí)，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOB的相對(duì)豐度分別為0.17、0.12、0.18、0.18，經(jīng)過(guò)28 d培養(yǎng)，AOB相對(duì)豐度分別為0.14、0.20、0.25、0.20，CK處理經(jīng)過(guò)28 d培養(yǎng)AOB的相對(duì)豐度有所下降，其余各處理的相對(duì)豐度有所上升。0 d時(shí)，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中NOB的相對(duì)豐度分別為0.83、0.88、0.82、0.82，經(jīng)過(guò)28 d培養(yǎng)，NOB 相對(duì)豐度變?yōu)?.87、0.80、0.75、0.82，其中NH4Cl處理中NOB的相對(duì)豐度有所下降。

3　討 論

本試驗(yàn)供試土壤為石灰性紫色土，pH較高，與CK相比，(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理均刺激土壤硝化作用的發(fā)生。NH3是自養(yǎng)氨氧化微生物的唯一能量來(lái)源。土壤中H+的濃度決定了土壤中NH3的存在狀態(tài)，如果土壤中H+的濃度較高，那NH3以AOA和AOB不能利用的NH4+離子態(tài)存在。已有研究表明pH在4.8～8.5的范圍內(nèi)時(shí)，土壤 中硝化速率隨著pH的增加而增強(qiáng)［23-25］，這與前人研究一致［1］。但是三種不同底物之間的硝化作用強(qiáng)弱不一，其中NH4Cl處理延緩了 硝態(tài)氮的累積，抑制了銨態(tài)氮的減少，這可能是由于不同氮源引入了不同的陰離子，對(duì)土壤硝化作用產(chǎn)生了影響。前人研究表明，SO42-對(duì)硝化作用具有促進(jìn)作用；Cl-對(duì)硝化作用的抑制效果也進(jìn)一步被肯定［26］，可以降低氮素?fù)p失，就如同在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中施用硝化抑制劑 來(lái)有效降低土壤的硝化速率［27-28］，以提高氮肥利用率。

氨氧化作用是硝化作用的第一步，也是限速步驟，是全球氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。AOA的發(fā)現(xiàn)為氨氧化作用的研究開啟了新方向［29］。大量研究表明AOB和AOA在不同生境的硝化作用中發(fā)揮著重要作用［30-31］。本試驗(yàn)所用石灰性紫色土，pH大于7，amoA功能基因拷貝數(shù)變化表明，AOB的豐度在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中變化顯著，而且與底物濃度變化相吻合，而AOA的豐度在CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下均無(wú)顯著變化，說(shuō)明AOB是石灰性紫色土硝化作用的主要推動(dòng)者，這與高pH下土壤硝化作用主要由AOB主導(dǎo)的研究相一致［32］。堿性土壤中AOB較AOA更為活躍，AOB參與了13CO2的固定和氨氧化過(guò)程［33］。Shen等［12］的研究也表明施肥對(duì)堿性土壤中AOB的影響要大于對(duì)AOA的影響且AOB的豐度與pH（8.3～8.7）和土壤的潛在硝化勢(shì)顯著相關(guān)。本試驗(yàn)借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)amoA功能基因拷貝數(shù)得出，NH4Cl處理的土壤中AOB的豐度在培養(yǎng)過(guò)程的第14天時(shí)顯著低于其他兩個(gè)處理（p＜ 0.05），而AOA在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中的amoA基因拷貝數(shù)也低于其他兩種氮源處理，但差異不顯著（p＞ 0.05），這可能因?yàn)锳OA主要在低pH、寡營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境的硝化作用中發(fā)揮作用［1］，因此在高pH的石灰性紫色土硝化作用中不起主導(dǎo)作用，進(jìn)而氮源的加入對(duì)AOA并無(wú)明顯刺激，但amoA功能基因拷貝數(shù)變化暗示Cl-對(duì)AOB產(chǎn)生了抑制。Darrah等［34］在1985年運(yùn)用Monod方程模擬氯化銨對(duì)硝化細(xì)菌的響應(yīng)得出，添加氯化銨N超過(guò)7.3 μmol g-1就產(chǎn)生抑制效果。蘇天明等［35］研究也得出了氯化銨的施用減少了亞硝酸細(xì)菌的數(shù)量，降低了硝酸鹽的含量。Jooste和van Leeuwen［36］關(guān)于含氯消毒劑對(duì)亞硝酸鹽累積的研究中得出了含氯消毒劑通過(guò)抑制亞硝酸氧化菌降低了硝酸鹽的積累。以上研究均表明了氯通過(guò)抑制硝化微生物進(jìn)而抑制了硝酸鹽的累積。本試驗(yàn)進(jìn)化分析表明CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理并未改變AOBamoA功能基因類群，屬于亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）Cluster 3 ，而AOAamoA功能基因類群主要是Group 1.1b ，這與許多重要研究結(jié)果相互印證［37］，為認(rèn)識(shí)氨氧化微生物的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子提供資料補(bǔ)充。

亞硝酸氧化是硝化作用的第二步，由NOB主導(dǎo)完成。由于氨氧化作用被認(rèn)為是硝化作用的限速步驟，同時(shí)AOA的發(fā)現(xiàn)［29］以及NOB在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中相比AOB和AOA更難生長(zhǎng)［5］，因此多年來(lái)人們對(duì)硝化作用的研究主要集中在氨氧化作用。硝化微生物對(duì)底物的利用范圍十分有限，AOB、AOA和NOB共存于復(fù)雜的環(huán)境中，這意味著這些微生物對(duì)資源利用有不同的方式。最近一項(xiàng)驚奇的研究發(fā)現(xiàn)屬于硝化螺菌屬NitrosospiraSublineageⅡ的菌群能夠催化全程硝化作用，與其他硝化微生物不同的是，這類全程氨氧化微生物（Comammox）含有催化氨氧化和亞硝酸氧化的全部基因，且從已發(fā)表的宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中分析發(fā)現(xiàn)這種全程氨氧化微生物廣泛分布于稻田和其他農(nóng)業(yè)土壤、森林土壤、稻田水域、淡水環(huán)境如濕地，河床，含水層和湖泊沉積物，以及工程系統(tǒng)（活性污泥和飲用水處理廠），ComammoxNitrospira是自然系統(tǒng)微生物群落中常見(jiàn)的硝化細(xì)菌［17-18］。全程氨氧化微生物的發(fā)現(xiàn)也符合單步硝化能夠釋放更多自由能的熱力學(xué)理論［5］。氨氧化微生物（AOM）將氨氧化為亞硝酸鹽能夠產(chǎn)生6個(gè)電子，較NOB將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽產(chǎn)生的電子多三倍，由于氨氧化微生物代謝時(shí)氨單加氧酶活化氨需要2個(gè)電子，因此氨氧化微生物每轉(zhuǎn)化一個(gè)單位的氮真正 釋放的能量實(shí)際上只比亞硝酸氧化細(xì)菌釋放的 能量多2倍，這就意味著環(huán)境中AOM的數(shù)量應(yīng)該較NOB多［38-40］。本試驗(yàn)通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，土壤中NOB占總微生物的比例卻高于AOB占總微生物的比例，并且以Nitrospira為主，推測(cè)供試土壤可能存在全程氨氧化微生物，也可能NOB較AOB具有更高的生長(zhǎng)和新陳代謝轉(zhuǎn)化速率。Wang等［41］利用13CO2穩(wěn)定性同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)四種水稻土的培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，被標(biāo)記的Nitrospira豐度也遠(yuǎn)高于AOB和AOA，這與我們的試驗(yàn)結(jié)果相似。Daims等［5］認(rèn)為相同環(huán)境中Nitrospira的豐度高于AOB和AOA預(yù)示著全程氨氧化微生物的存在。

4　結(jié) 論

(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理均刺激石灰性紫色土硝化作用的發(fā)生，但是相比于(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理，NH4Cl處理延緩了硝態(tài)氮的累積，對(duì)硝化作用有抑制效果。石灰性紫色土硝化作用的主要推動(dòng)者為AOB，但氯離子對(duì)AOB有抑制。石灰性紫色土中AOB的優(yōu)勢(shì)種群為NitrosospiraCluster 3，AOA的優(yōu)勢(shì)種群是Group 1.1b，NOB的優(yōu)勢(shì)種群為Nitrospira。石灰性紫色土中NOB占土壤總微生物的比例高于AOB，可能存在全程氨氧化微生物。

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