王輝 謝榮俊 劉龍飛 李峰

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率逐年升高，雖然結(jié)腸癌5年生存率較高，但其高復(fù)發(fā)性及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移是最主要死因。神經(jīng)纖毛蛋白-1（Neuropilin n-1,NRP-1）為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的一種新型細(xì)胞受體，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移[1]。本研究分析Neuropilinns-1在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系，旨在為結(jié)腸癌診治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1一般資料 收集2011年9月～2012年3月我院胃腸外科手術(shù)結(jié)腸癌患者石蠟切片58例，所有患者具有完整臨床資料及隨訪資料。男36例，女22例，年齡31～86歲。按照第七版AJCC/UICC的標(biāo)準(zhǔn)TNM分期，Ⅰ/Ⅱ期15例，Ⅲ期43例。對(duì)入選患者采用書信和電話進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間3～32月，以患者出院為隨訪起點(diǎn)，死亡或最后隨訪時(shí)間為終點(diǎn)，終止隨訪時(shí)間為2014年10月30日。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 免疫組織化學(xué)檢測(cè)NRP-1蛋白的表達(dá)，石蠟切片脫蠟，3%H2O2阻斷過氧化物酶，抗原修復(fù)，血清封閉，上NRP-1一抗，4℃過夜，上二抗溫育，加抗生物素蛋白工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、固定。以PBS作為對(duì)照物，細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或者細(xì)胞核呈現(xiàn)淺黃色、黃色、棕褐色分別為弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性。圖像分析：20倍顯微鏡下計(jì)算隨機(jī)100個(gè)陽性細(xì)胞灰度值的平均值（背景灰度值-實(shí)測(cè)灰度值），灰度值越小，顏色越深。兔抗人NRP-1單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Novus公司，二抗及免疫組化試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以±s表示計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，生存分析使用Kaplan-Meier法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1免疫組化檢測(cè)結(jié)腸癌中NRP-1蛋白的表達(dá)情況 NRP-1主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿內(nèi)，結(jié)腸癌細(xì)胞異性明顯，核分裂明顯，見圖1、2。結(jié)腸癌組織中NRP-1蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織，見表1。

圖1　癌旁組織中NRP-1蛋白的表達(dá)（S P×200）

圖2　結(jié)腸癌中NRP-1蛋白的表達(dá)（S P×200）

表1　結(jié)腸癌及癌旁組織中 NRP-1蛋白的表達(dá)（±s）

表1　結(jié)腸癌及癌旁組織中 NRP-1蛋白的表達(dá)（±s）

組織 NRP-1 表達(dá) NRP-1陽性[n(%)]結(jié)腸癌組織 138.17±9.05 39（67.24）癌旁組織 92.42±7.81 7（12.07）t/χ22.46418.445 P 0.017 0.016

2.2生存分析 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，NRP-1陽性表達(dá)患者的32月生存率明顯低于陰性表達(dá)患者（χ2=6.832，P=0.009），見圖 3。

圖3　NRP-1陽性及陰性表達(dá)結(jié)腸癌患者生存率曲線圖

3　討論

NRP-1最初研究多數(shù)集中在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病中，近年來，NRP-1被發(fā)現(xiàn)在多數(shù)惡性腫瘤中高度表達(dá)而逐漸被重視。Ding[2]在小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)NRP-1與腫瘤密切相關(guān)，并且NRP-1可能介導(dǎo)腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，具體途徑可能為參與腫瘤血管生成。國(guó)內(nèi)學(xué)者李明[1]在胃癌中也發(fā)現(xiàn)，NRP-1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織NRP-1表達(dá)明顯升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)與VEGF也密切相關(guān)，由此推斷NRP-1可能扮演VEGF受體角色，參與腫瘤血管的生成，從而介導(dǎo)胃癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中NRP-1蛋白高度表達(dá)，而在癌旁組織為低度表達(dá)，說明NRP-1與結(jié)腸癌相關(guān)，參與結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展。生存分析中發(fā)現(xiàn)，NRP-1陽性表達(dá)結(jié)腸癌患者32月生存率明顯低于陰性表達(dá)患者，更進(jìn)一步說明NRP-1的高表達(dá)參與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展，并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

NRP-1可分為膜性NRP-1和可溶性NRP-1，是具有跨膜功能的糖蛋白，位于細(xì)胞表面的神經(jīng)纖維軸突上，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向、軸突生長(zhǎng)作用，正常機(jī)體中的NRP-1主要在內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞等組織表達(dá)[3]?？勺鳛槭荏w與多種配體如Sema3、胎盤生長(zhǎng)因子2、TGF-β1、bFGF、VEGF和PDGF等結(jié)合[4]。研究顯示，NRP-1可與VEGF家族中較多的血管生成因子的酪氨酸激酶受體相互作用，從而增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)血管生成，誘發(fā)腫瘤的生成，并促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中NRP-1還可以作為啟動(dòng)子，對(duì)腫瘤侵襲和進(jìn)展均發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，超過98%的NRP-1高表達(dá)均來自腫瘤血管，并且其表達(dá)水平主要取決于腫瘤組織來源、組織大小和分期程度，還與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后不良相關(guān)。在各種基質(zhì)中也有NRP-1的表達(dá)，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞，并被不同的VEGF-A生長(zhǎng)因子所激活，從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[6]。因此，NRP-1通過多種途徑和因素參與腫瘤的發(fā)生，這是因?yàn)槟[瘤的形成本身就是多種機(jī)制參與的“交叉對(duì)話”[7]。

綜上所述，NRP-1的高度表達(dá)與結(jié)腸癌密切相關(guān)，參與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展，并導(dǎo)致患者預(yù)后不佳。因此NRP-1可作為評(píng)價(jià)結(jié)腸癌生物學(xué)行為指標(biāo)之一，并對(duì)監(jiān)測(cè)患者生存期具有一定的指導(dǎo)作用，同時(shí)，NRP-1也可能對(duì)結(jié)腸癌靶向治療具有一定的臨床價(jià)值。但是，本研究仍有不足之處，如非前瞻性研究，必然可能造成選擇性偏倚；實(shí)驗(yàn)中缺少結(jié)腸正常組織對(duì)比，不清楚NRP-1在正常結(jié)腸組織中的表達(dá)情況；研究只說明NRP-1蛋白在結(jié)腸癌的表達(dá)和結(jié)腸癌患者預(yù)后情況，未系統(tǒng)闡明其參與的相關(guān)機(jī)制，以上這些不足之處將在后續(xù)研究中得以補(bǔ)充，以完善本課題研究方案。

1 李明，李強(qiáng). Neuropilin-1 及VEGF 在胃癌組織中的表達(dá)與微血管生成的關(guān)系[J]. 中國(guó)腫瘤臨床，2014，5（41）：332-336

2 Ding M，Liu L，Hu C，et al.Expression of VEGFR2 and NRP-1 in non-small cell lung cancer and their clinical significance[J].Chine J Cancer Res，2014，26（6）：669-677

3 Jubb AM，Strickland LA，Liu SD，et al.Neuropilin-1 expression in cancer and development[J].J Pathol，2012，226（1）：50-60

4 Choi J，Yang ES，Cha K，et al.The Nuclear Matrix Protein，NRP/B，Acts as a Transcriptional Repressor of E2F-mediated Transcriptional Activity[J].Journal of Cancer Prevention，2014，19（3）：187-198

5 Zachary I. Neuropilins： role in signalling，angiogenesis and disease[J].Chem Immunol Allergy，2014，99：37-70

6 Sun J，Wang L，Lou W，et al.NRP-1/shRNA silencing suppresses nasopharyngeal carcinoma cell growth in vitro and in vivo[J].Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2015，50（4）：312-317

7 王輝，牛國(guó)梁，張樹友，等. 姜黃素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞裸鼠移植瘤放射增敏的作用[J]. 中國(guó)癌癥雜志，2012，5（22）：342-346