劉書琴

摘要：目的：觀察不同濃度的谷氨酸預處理對星形膠質(zhì)細胞胞膜上興奮性氨基酸受體（EAAT2）表達的影響。方法：在純培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞上，用低濃度的谷氨酸溶液進行連續(xù)短時刺激，用Western Blot法檢測該細胞EAAT2的表達量，以觀察谷氨酸預處理對星形膠質(zhì)細胞的影響。結果：谷氨酸預處理能夠增加EAAT2的蛋白表達量，在10μmol/L濃度的谷氨酸預處理細胞2h復灌6h最顯著。結論：較低濃度的谷氨酸作用較長時間可以增加EAAT2的表達量。

關鍵詞：谷氨酸預處理；星形膠質(zhì)細胞；EAAT2

發(fā)生腦缺血時腦部損傷部位會產(chǎn)生大量的谷氨酸，谷氨酸的積聚會對神經(jīng)細胞產(chǎn)生興奮性毒性，研究表明這是導致神經(jīng)元產(chǎn)生繼發(fā)性損傷的關鍵。在生理條件下，谷氨酸會被興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體（EAAT）清除，EAAT的一種主要分布在星形膠質(zhì)細胞上的亞型EAAT2清除谷氨酸作用尤其明顯。有研究報道，腦缺血損傷后，星形膠質(zhì)細胞EAAT2表達會明顯增加[1]，在星形膠質(zhì)細胞上過表達EAAT2，可保護中等程度的腦缺血損傷[2]。所以，通過增強EAAT2的表達可保護神經(jīng)元。但如何才能實現(xiàn)臨床可應用的EAAT2表達增強呢？有報道說明一定量的谷氨酸會誘導EAAT2的表達，本研究試圖探討通過谷氨酸的預處理能否改變星形膠質(zhì)細胞EAAT2的表達，進而產(chǎn)生保護作用。

一、材料和方法

1、實驗主要試劑和儀器 谷氨酸（Glu）、頭孢曲松鈉（CEF）、丙烯酰胺、甲又雙丙烯酰胺均購自Sigma公司，RIPA裂解液購自碧云天生物技術研究所，一抗兔抗大鼠EAAT2多克隆抗體、一抗兔抗大鼠GFAP多克隆抗體、二抗鼠抗兔抗體均購自武漢博士德生物有限公司。

2、星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng) 取出生24h內(nèi)的Sprague-Dawley大鼠新生鼠，75%乙醇消毒，斷頭取腦并在解剖顯微鏡下分離出大腦皮層組織，至于0.25%的胰酶中消化18min（37℃）。用5%FBS終止消化后，DMEM清洗，機械吹打分離細胞，收集細胞懸液離心沉淀，最后將細胞重懸于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，種植于培養(yǎng)瓶內(nèi)。3-5天換液，9-10天后于恒溫搖床260rpm搖12小時以去除神經(jīng)元細胞和小膠質(zhì)細胞等，棄除細胞懸液后0.25%的胰酶中消化1-3min（37℃），5%FBS終止消化后吹打懸浮細胞，離心沉淀后再重懸細胞于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中。

3、蛋白質(zhì)樣品制備 取出RIPA裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的終濃度為1mM待用。將處理后的細胞培養(yǎng)液吸去，用PBS洗兩遍，之后加入溶解了PMSF的裂解液，每孔200ul，放在冰上震蕩15min。用刮板刀輕輕刮每個孔底部，能看到淡淡白色物質(zhì)，將每孔內(nèi)的物質(zhì)分別吸到每個EP管內(nèi)，輕輕吹打數(shù)次后4℃12000g離心30min。將每孔上清分別吸至新EP管，-20℃保存。

4、蛋白印跡法（western blot） 蛋白定量配平各組蛋白濃度后，加入SDS Loading Buffer95℃變性5min，樣品蛋白（20μg）行10%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜。5﹪羊血清封閉硝酸纖維素膜2 h后，加入EAAT2抗體（1：400）、GFAP抗體（1：2000）或β-actin一抗（1：2000），4℃反應過夜。次日洗膜，加入1：1000辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2h，洗膜后加ECL顯色劑，X片顯影。Image J圖象分析軟件根據(jù)光密度定量分析。

二、觀察指標

每組設置空白組，絕對興奮組及實驗組，絕對興奮組選用CEF（頭孢曲松鈉）作為絕對興奮劑，取兩種不同濃度。星形膠質(zhì)細胞在六孔細胞板上進行預處理，每組實驗擬定兩塊細胞板。

1、每塊細胞板控制預處理的Glutamate溶液和CEF溶液的溶度相同，預處理30 min，處理結束后換上新鮮培養(yǎng)液，復灌6 h。

2、每塊細胞板控制預處理的Glutamate溶液和CEF溶液的溶度相同，預處理2 h，處理結束后換上新鮮培養(yǎng)液，復灌6h。

3、細胞板控制預處理的Glutamate溶液和CEF溶液的時間為2 h，每組下采用Glutamate濃度梯度處理細胞。

4、細胞板控制預處理的Glutamate溶液和CEF溶液的時間為48 h，每組下采用Glutamate濃度梯度處理細胞。

5、以上處理結束后，均用western-blotting方法對蛋白進行分離和定量分析。

6、實驗數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均由Microsoft office2010處理，進行假設t檢驗；圖均用Graphpad Prism5繪制。

三、實驗結果

3.1不同濃度的Glutamate預處理30min復灌6h對EAAT2表達的影響

如圖1所示，各濃度Glutamate處理30min都不能明顯增加EAAT2的表達量，陽性對照CEF組能明顯增加EAAT2的表達量。

30min/6h谷氨酸處理后EAAT2表達的Western blot灰度分析結果。Image J圖象分析軟件根據(jù)光密度定量分析。數(shù)值均以control組值作為對照進行標準化，并以mean ± SEM （n≥4）的形式給出。*P<0.05與Control組相比。

3.2不同濃度的Glutamate預處理2h復灌6h對EAAT2表達的影響

如圖2所示，10uM Glutamate處理2h可以明顯增加EAAT2的表達量，陽性對照CEF組能明顯增加EAAT2的表達量。

2h/6h谷氨酸處理后EAAT2表達的Western blot灰度分析結果。Image J圖象分析軟件根據(jù)光密度定量分析。數(shù)值均以control組值作為對照進行標準化，并以mean ± SEM （n≥4）的形式給出。*P<0.05，**P<0.01與Control組相比。

四、討論

腦缺血損傷時，谷氨酸因過度釋放會大量積聚在損傷部位的神經(jīng)細胞突觸間隙中，這將會過度激活細胞膜上的受體，對神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性，是神經(jīng)細胞功能損傷的重要病理生理基礎[3]。谷氨酸轉(zhuǎn)運體可以攝取損傷產(chǎn)生的大量谷氨酸，研究表明多種生理和病理生理的刺激能調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的活性和表達：低濃度Glu作用6h，大腦皮層神經(jīng)細胞即有凋亡細胞的出現(xiàn)，12h后漸增多，以18h達到高峰，為12%[4]。因此，星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)是基礎與臨床神經(jīng)科學研究的基礎，研究星形膠質(zhì)細胞Glutamate等化學因素損傷后的細胞內(nèi)分子表達的改變，對于研究疾病機理、指導臨床診斷治療具有一定的意義。

本研究中，各濃度組谷氨酸處理30min復灌6h后，10uM濃度組能稍微增加EAAT2的表達，但并沒有顯著性差異，所以，我們得出結論：各濃度谷氨酸處理30min都不能明顯增加EAAT2的表達量，陽性對照CEF組能明顯增加EAAT2的表達量。各濃度組谷氨酸處理2h復灌6h后，能夠明顯增加EAAT2的表達量，并且在10uM濃度組最為明顯（P<0.01），甚至和陽性對照組相當，所以，我們得出結論：10uM 谷氨酸處理2h復灌6h能明顯增加EAAT2的表達量。最終結論為：谷氨酸預處理能夠增加EAAT2的蛋白表達量，在10μmol/L濃度的谷氨酸預處理2h最顯著。即較低濃度的谷氨酸作用較長時間可以增加EAAT2的表達量。

參考文獻：

[1]粱輝，陳虎，蔡定芳.急性腦缺血損傷大鼠海馬神經(jīng)元谷氨酸轉(zhuǎn)運體的表達[J].中國病理生理雜志，2005，21（6）： 1061-1065.

[2]張光運，段麗，饒志仁.局灶性腦梗死引起谷氨酸轉(zhuǎn)運體在星形膠質(zhì)細胞的表達[J].解剖學報，2004，35（6）：574-577.

[3]Lo EH，Moskowitz MA，Jacobs TP.Exciting radical suicidal： how brain cells die a Rerstroke[J].Stroke， 2005，36（2）： 189-192.

[4]楊翠，趙晏.谷氨酸介導的大腦皮層神經(jīng)細胞凋亡[J].西安醫(yī)科大學學報，2001，22（3）：75-77.

基金項目：作者主持皖南醫(yī)學院2017年度中青年科研基金項目“谷氨酸預處理對星形膠質(zhì)細胞EAAT2表達和氧糖剝奪神經(jīng)元存活率的影響”（編號：WK201701）