齊小慧，孫軍勇，謝廣發(fā)，陸健*

1 (江南大學,工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學，糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)4(中國紹興黃酒集團有限公司 國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興，312000)

根據國家標準GB/T 13662—2008《黃酒》[1]的定義，黃酒是指以稻米、黍米等為主要原料，經加曲、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒。黃酒中含有豐富的氨基酸、無機鹽、微量元素、維生素和多種活性物質，不僅營養(yǎng)豐富，而且長期以來被認為是保健養(yǎng)生品，還可用作中藥藥引服用[2]。實驗證明[3]，飲用黃酒有助于排鉛、增強記憶力和免疫力、抗氧化、抗衰老、預防骨質疏松等。蛋白質在黃酒中含量比較豐富，為各釀造酒之首[4-6]。紹興花雕酒蛋白質含量為5.78 g/L，紹興加飯酒總蛋白質含量高達16 g/L，是啤酒的4倍，紅葡萄酒的16倍[7-8]。黃酒中的蛋白質作為黃酒重要的組成成分，對黃酒的營養(yǎng)價值、風味及保健功能等都有較顯著影響，而蛋白質對黃酒的非生物穩(wěn)定性的影響最為顯著。

黃酒作為中國最古老的酒種，具有數千年的發(fā)展歷史，曾是全國性的飲料酒，但由于各種原因，黃酒目前的發(fā)展已經落后于整個酒業(yè)的發(fā)展速度，年產量與產值遠低于白酒，且與葡萄酒相比，雖然其年產量較高，年產值卻低于葡萄酒[9]。近年來，黃酒因其營養(yǎng)、保健等功效被熟知，逐漸被重視，加強對黃酒成分的研究將有助于黃酒產業(yè)的發(fā)展。本文從黃酒蛋白的角度出發(fā)，綜述了黃酒蛋白的來源、含量、分布以及其對黃酒品質的影響，提出目前存在的問題及今后的研究方向。

1　黃酒酒體的蛋白質

近年來，對黃酒蛋白質的研究大多是圍繞著渾濁蛋白進行的，對于酒體蛋白的研究相對較少。通過分析不同類型及陳釀年份的黃酒發(fā)現(xiàn)[4,7,10]，黃酒中低分子蛋白的含量最高，高分子蛋白的含量最少，且隨著陳釀年份的增加而發(fā)生改變：當年新酒中蛋白質的分子質量以10 kDa左右為主，而隨著陳釀年份的增加，低分子質量蛋白的含量變化不明顯,高分子量蛋白的含量明顯下降。

目前對于黃酒酒體蛋白的種類、數量及來源的研究還未開展，一些研究者認為[8]，黃酒中的蛋白質主要來源于大米和麥曲，還有少量的微生物蛋白和酶蛋白。通過合適的方法分離出酒體蛋白，并采用雙向電泳技術及基質輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質譜法等方法，可以鑒定黃酒酒體蛋白的種類、數量及來源。

1.1　麥曲來源的蛋白質

小麥中含有大量的可溶性蛋白，在制曲過程中由于米曲霉等微生物的存在，一些小麥蛋白質會被降解；在對渾濁蛋白的研究中鑒定出小麥來源的渾濁蛋白，說明也有一些小麥蛋白未被降解，如二聚-α-淀粉酶抑制劑等[11-12]。

張波等[13]對未接種熟小麥、熟麥曲及制曲過程中4個不同時期(即孢子萌發(fā)期、菌絲生長期、菌絲繁殖期和孢子著生期)的麥曲中宏蛋白質組進行分析，結果表明，未接種熟小麥中的蛋白為原料小麥蛋白，到菌絲繁殖期原料小麥蛋白基本被米曲霉分泌的蛋白酶降解。ODA等[14]蛋白質組學分析也表明，小麥蛋白在培養(yǎng)24 h時幾乎被米曲霉分泌的蛋白酶降解。有研究者認為[15]，紹興黃酒成品麥曲中的小麥蛋白絕大部分在制曲過程中被降解，因此麥曲中的可溶性蛋白大部分為微生物分泌的胞外酶。但孔令瓊[16]對黃酒麥曲中的宏蛋白質組進行分析時卻發(fā)現(xiàn)，鑒定出的124個蛋白點中非生物來源的蛋白點共有113個，其中有100個蛋白點來源于小麥，包括22種蛋白；6個蛋白點來源于水稻，包括3種蛋白；而微生物來源的蛋白點只有11個；鑒定出的非生物來源的蛋白質主要是酶抑制劑類，例如α-淀粉酶抑制劑等，另外還有水解酶類以及少量其他酶。造成這種結果差異的原因可能是選取了制曲過程不同時期的麥曲作為實驗樣品。

1.2　大米來源的蛋白質

傳統(tǒng)黃酒釀造多選用糯米為原料，糯米中含有豐富的淀粉、蛋白質、脂肪、維生素等[17]。與原料小麥中的蛋白質類似，原料糯米中的蛋白質經過浸泡、蒸煮和發(fā)酵后，大部分已經被蛋白酶分解為肽和氨基酸，還有少量蛋白質未被分解保留在酒液中，例如類燕麥蛋白和β-淀粉酶[11,18]。經研究發(fā)現(xiàn)[18]，糯米中總蛋白含量為8.10%～10.30%之間，可溶性蛋白含量為0.15 ～0.49 mg/L，糯米中蛋白質的含量在很大程度上影響黃酒中游離氨基酸的含量。代鈺等[19]采用稀堿法提取糯米蛋白，確定了最佳提取工藝：堿液濃度0.05 mol/L，溫度45.68 ℃，料水比8∶1，時間94.56 min，但未對糯米蛋白的種類進行鑒定。

1.3　酵母來源的蛋白質

有關葡萄酒的研究表明[20]，在葡萄酒的儲酒階段，自溶和死亡的酵母體內的蛋白質和蛋白酶會釋放到酒液中，對成品葡萄酒的蛋白穩(wěn)定性產生影響。黃酒中也有可能存在類似的問題，因為黃酒有長達4個月的后酵期，酵母也可能會自溶、死亡，其體內的蛋白質也會釋放到酒液中，但此推測是否正確還需對黃酒酒體蛋白及其來源做進一步的研究。

2　蛋白質對黃酒品質的影響

2.1　蛋白質對黃酒營養(yǎng)成分的影響

蛋白質在黃酒中主要以氨基酸和肽的形式存在，人體容易吸收利用。氨基酸是一種重要的營養(yǎng)成分，在黃酒中的含量極其豐富，種類多達21種，其中包括8種必需氨基酸，且在各釀造酒中必需氨基酸的含量最豐富、種類最齊全[8]。紹興加飯酒中含有4.3 g/L左右的游離氨基酸，其中必需氨基酸約占34.9%，半必需氨基酸約占27.9%；紹興加飯酒中的總氨基酸含量是日本清酒的1.3倍以上，啤酒的6.0倍以上，葡萄酒的3.7倍以上[8,21-23]。氨基酸態(tài)氮是黃酒的重要質量指標，根據國家標準GB/T 13662—2008《黃酒》[1]規(guī)定，黃酒中氨基酸態(tài)氮的最低含量為0.3 g/L。表1所示為不同品牌黃酒中氨基酸態(tài)氮及氨基酸的含量。從表1中可知黃酒中氨基酸含量高的酒樣其氨基酸態(tài)氮的含量相對也高，說明氨基酸態(tài)氮的含量能反應黃酒中氨基酸總體水平；氨基酸含氮量占氨基酸態(tài)氮比例越高，說明蛋白質的降解程度越大[24]。

表1　不同類型黃酒中氨基酸態(tài)氮及氨基酸的含量[24]Table1　Contents of amino acids and amino acids nitrogen in different types of Chinese rice wine

氨基酸對黃酒的色、香、味、形等各方面均有重要的貢獻。首先，在陳釀時，氨基酸與低分子糖類物質通過氨基-羥基反應產生類黑精，是黃酒顏色的重要來源。氨基酸本身也是黃酒的重要風味物質，不同的氨基酸分別呈鮮、甜、苦、澀等味感，在一定程度上決定著黃酒的口味。同時，氨基酸也是黃酒中酵母代謝產生高級醇等揮發(fā)性風味物質的前體[24]。

同時，氨基酸和肽也賦予了黃酒一定的保健功能。黃酒中含有具有生理活性的肽，其中一些多肽具有抗氧化能力，能預防因自由基產生過多而引起的疾病，還含有降血壓功能的降壓肽[25-26]。謝廣發(fā)等[3]成功鑒定出古越龍山加飯酒中的5種降血壓活性肽(其氨基酸序列分別為Gln-Ser-Gly-Pro、Val-Glu-Asp-Gly-Gly-Val、Pro-Ser-Thr、Asn-Thr、Leu-Tyr)和另外一種降膽固醇活性肽(氨基酸序列為Cys-Gly-Gly-Ser)。黃酒中還富含天然非蛋白質氨基酸-γ-氨基丁酸(GABA)，它是一種重要的抑制性神經遞質，具有降血壓、改善腦功能、延緩腦衰老等功效[8]。

2.2　蛋白質對黃酒渾濁的影響

黃酒釀造發(fā)展至今，消費者對其品質的要求越來越高，澄清的黃酒更容易被接受，然而非生物渾濁問題是黃酒行業(yè)仍然存在的亟待解決的問題之一。黃酒中蛋白質、多糖、多酚、金屬離子等物質的存在使渾濁機理相對復雜，但根據目前的研究結果，認為蛋白質是引起黃酒非生物渾濁的主要原因[4-6]。

非生物渾濁的形成較為復雜，從形成機理來說，可分為蛋白質渾濁、鐵渾濁和氧化渾濁[27]。此外，還有草酸鈣渾濁[28]。其中蛋白質渾濁被認為是最主要、同時也是研究最多的渾濁成因。

2.2.1黃酒渾濁蛋白

楊國軍等[7]通過對比不同酒樣的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，黃酒穩(wěn)定性與酒中的某種特定蛋白有關，去除該類蛋白可提高黃酒穩(wěn)定性，但作者并未指出這種特定蛋白是哪一類蛋白。表2所示為不同儲存年份的紹興花雕酒中蛋白質的分布、含量及穩(wěn)定性。隨著儲存時間延長，總蛋白質含量降低，穩(wěn)定性增加，說明蛋白質影響黃酒的非生物穩(wěn)定性[7]。譚新勇[11]采用雙向電泳技術及基質輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質譜法，鑒定出紹興黃酒渾濁蛋白質主要有二聚-α-淀粉酶抑制劑、類燕麥蛋白、病程相關蛋白、幾丁質酶Ⅱ和β-淀粉酶。其中來源于小麥的蛋白有二聚-α-淀粉酶抑制劑、類燕麥蛋白、病程相關蛋白、和幾丁質酶Ⅱ，來源于水稻的蛋白有類燕麥蛋白和β-淀粉酶，由此推斷，黃酒渾濁蛋白主要來源于大米和麥曲原料[11-12]。圖1所示為渾濁蛋白雙向電泳圖。通過分析多種紹興黃酒的渾濁蛋白發(fā)現(xiàn)，渾濁蛋白中含量最高的為二聚-α-淀粉酶抑制劑。

表2　不同儲存年份紹興花雕酒中蛋白質的分布、含量及穩(wěn)定性[7]Table 2　Protein distribution, content and stability in Shaoxing Huadiao with different age

圖1　渾濁蛋白雙向電泳圖譜[12] Fig.1　2-DE profiles of haze proteins in Chinese ricewine samples粗箭頭()所指為二聚-α-淀粉酶抑制劑的蛋白點，細箭頭(←)所指為類燕麥蛋白

二聚-α-淀粉酶抑制劑是α-淀粉酶抑制劑的二聚體，分子質量為24 kDa，在制曲過程中未被降解而保留至成品黃酒中[12]。王文蒙[29]研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶抑制劑具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性，當溫度低于80 ℃時，α-淀粉酶抑制劑的活性幾乎不受影響，在80 ℃下作用30 min，抑制活性僅損失10%左右，且在pH3～10之間抑制活性相對穩(wěn)定。俞關松等[30]檢測黃酒pH值約為3.50～4.50，由此推斷在此pH值下α-淀粉酶抑制劑的活性較為穩(wěn)定。因此，在黃酒煎酒的過程中α-淀粉酶抑制劑依然穩(wěn)定存在，在瓶裝黃酒運輸、銷售過程中受環(huán)境因素的影響慢慢析出，形成渾濁。小麥類燕麥蛋白具有高含量的半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基是形成二硫鍵的基礎，而二硫鍵有助于蛋白之間的聚合，對渾濁的形成有重要影響[31]。

孫軍勇等[12]對瓶裝黃酒渾濁蛋白與酒體蛋白的氨基酸的分析表明，渾濁蛋白中谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸的含量較高，而在酒體蛋白中含量較高的前3位分別是谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸。其中谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和絲氨酸的疏水值為分別為0、0、2.6和-0.3，谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸屬于親水性氨基酸，脯氨酸屬于疏水性氨基酸[12]?？梢姡瑴啙岬鞍椎氖杷愿哂诰企w蛋白，導致其更容易從黃酒中析出。

2.2.2蛋白渾濁機理的研究

在成品黃酒中，蛋白質與酒中其它物質以膠體的狀態(tài)存在，此時酒液澄清。在黃酒儲存、運輸過程中，由于外界環(huán)境的改變，以及酒體各組分物質的變化，膠體狀態(tài)被破壞，出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。其中由蛋白質引起的渾濁可分為3種類型[27,32]：

(1)冷渾濁：冷渾濁屬于可逆渾濁，是由β-球蛋白和醇溶蛋白與單體多酚結合形成可溶性多酚-蛋白質復合物而產生的。溫度較高時，蛋白質和水結合形成氫鍵，酒液澄清；溫度降低時，蛋白質與水形成的氫鍵斷裂，然后與多酚結合形成渾濁。

(2)氧化渾濁：氧化渾濁屬于不可逆渾濁，酒液長期放置時，在鐵離子催化下，含巰基蛋白質被氧化，聚合成大分子蛋白，與聚多酚結合形成沉淀。

(3)熱渾濁：熱渾濁屬于不可逆渾濁，是由高分子蛋白受熱變性進而聚合析出形成的。熱力作用破壞了高分子蛋白質的水化膜，蛋白質之間的電荷平衡被打破，進而形成沉淀。

有研究表明[27]，黃酒渾濁的產生最初是由某些小分子物質相互作用，使酒液的平均粒度增大但<100 nm，出現(xiàn)“渾濁”現(xiàn)象，這些小分子物質在各種因素的作用下慢慢聚集，當酒液粒度>100 nm時，“渾濁”顆粒開始增大而沉降下來，形成沉淀。

研究者[33]在對葡萄酒的研究中模擬了渾濁蛋白-類甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLPs)的三維結構，研究發(fā)現(xiàn)，引起渾濁的原因主要是高溫環(huán)境下TLPs蛋白的三維結構被破壞，位于蛋白質內部的氨基酸側鏈暴露，該側鏈與其他蛋白質或葡萄酒中的其他組分結合，形成渾濁。蛋白質的結構決定其功能，不同的空間結構使蛋白質具有不同的理化性質和生理功能，在對TLPs蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，一些TLPs蛋白參與渾濁的形成，而另一些則不參與，這是由于TLPs蛋白不同異構體在結構上存在差異[33]。圖2所示為TLPs蛋白不同異構體(F2/4JRU、I/4L5H)的三維結構。圖2-A為兩種異構體蛋白二級結構的重疊，可以看出F2/4JRU與I/4L5H的二級結構相似，只在兩個環(huán)形區(qū)域有差異，其中圖2-B為結構域1中的差異，圖2-C為結構域2中的差異。此差異導致兩個蛋白異構體具有不同的熱穩(wěn)定性，F(xiàn)2/4JRU為熱不穩(wěn)定蛋白，參與葡萄酒渾濁的形成，I/4L5H則較為穩(wěn)定，不參與形成渾濁[33]。

A: F2/4JRU與I/4L5H二級結構重疊，箭頭所指為兩個結構的差異所在；B: 結構域1中結構差異；C: 結構域2中結構差異圖2　TLPs蛋白不同異構體(F2/4JRU、I/4L5H)的3D結構[33]Fig.2　The three-dimensional structures of TLP isoforms

黃酒渾濁的形成是否同樣是渾濁蛋白-二聚-α-淀粉酶抑制劑的三維結構發(fā)生了變化，也可通過獲取該蛋白的氨基酸序列模擬其三維結構來驗證。

一些研究者[5,23,34]認為,黃酒中蛋白質與多酚結合形成締合物是形成渾濁最主要的因素。林峰等[5]通過對酒腳成分的測定，以及對比酒腳與酒體成分的差異，推測高分子蛋白與單寧是形成渾濁的主要原因。江超等[10]通過分析不同年份的紹興加飯酒發(fā)現(xiàn)，隨著陳釀年份的增加，酒體中蛋白質和多酚的含量分別減少了55.23%和54.56%，由此推測蛋白與多酚結合是形成渾濁的主要原因。也有研究者[8]認為,黃烷醇類是影響黃酒渾濁的多酚物質。但目前為止，黃酒中多酚的種類尚不清楚，黃酒與多酚結合形成沉淀的機理也未得到證實。但黃烷醇參與葡萄酒蛋白渾濁的形成已經證實，圖3所示為葡萄酒蛋白與黃烷醇結合形成渾濁的機制[35]。首先需要檢測黃酒中多酚的種類，然后以葡萄酒蛋白與黃烷醇結合的機理為思路來驗證黃酒蛋白與多酚結合是否是形成渾濁的原因。

圖3　葡萄酒蛋白與黃烷醇結合形成沉淀的機理[35]Fig.3　Proteins precipitation via interaction with flavanols

2.2.3其他組分對渾濁形成的影響

瓶裝黃酒渾濁物中，除蛋白質外，還包括多酚、多糖、金屬離子鐵等成分。這些成分對渾濁的形成也有影響，然而由于缺乏深入的研究，它們的影響機制尚不清楚。本文結合葡萄酒中非蛋白組分的研究進行論述，提供今后的研究方向，若能明確非蛋白組分在黃酒渾濁形成中的作用，可為解決非生物渾濁問題提供理論指導。

黃酒多酚主要來源于小麥，目前的一些文獻普遍借鑒啤酒中的形成機制，認為主要是通過與蛋白質結合形成氫鍵，繼而形成渾濁，但此觀點在黃酒中是否正確還需實驗的驗證。

黃酒中的鐵離子主要來源于原料及生產設備的腐蝕，其在氧化渾濁中起催化作用，目前普遍認為鐵離子能促進黃酒渾濁的形成。黃酒中鐵離子以Fe3+的形式存在，F(xiàn)e3+與磷酸根離子結合形成帶負電荷的磷酸鐵膠體，此物質可與帶正電荷的蛋白質等物質發(fā)生凝聚而形成渾濁[6,8]。

有關多糖對于葡萄酒渾濁的影響的研究表明[36-37]，一些多糖能促進渾濁的形成，而一些低分子量的糖蛋白，例如甘露糖蛋白、阿拉伯半乳糖蛋白則抑制渾濁的形成。成品黃酒中含有大量的多糖，而且黃酒的陳釀時間較長，黃酒蛋白可能會與多糖結合形成糖蛋白，對渾濁的產生有一定的影響，且高度糖基化增加了蛋白分離純化的難度。但黃酒中多糖的種類以及多糖與蛋白質之間的結合位點尚不清楚，需要進一步的研究。

2.2.4提高黃酒蛋白穩(wěn)定性的方法

經發(fā)酵、陳釀后的原酒含有豐富的蛋白質，會引起瓶裝黃酒的渾濁，因此，工業(yè)上通常在黃酒勾兌后、包裝前，采用各種澄清技術去除導致黃酒渾濁的蛋白，常用方法有冷凍處理法、澄清劑法和微濾法等。

(1)冷凍處理法[8]：該方法將黃酒冷卻至-6～-2 ℃，并維持3～5 d。冷凍處理法以黃酒的冷渾濁為依據，短時間內降低黃酒的溫度，使酒液中的不穩(wěn)定物質沉淀析出，該方法效果比較明顯，但其耗電量較大，成本較高。

(2)澄清劑法[8]：澄清劑法是目前去除黃酒渾濁蛋白普遍使用的方法，常用的澄清劑有單寧、硅膠、皂土、PVPP、海藻酸鈉和海藻酸丙二醇酯等。通常單一的澄清劑處理效果不佳，實際生產中一般采用混合澄清劑處理。許多研究表明[38-41]，經過各種澄清方法處理之后，黃酒中蛋白質的含量明顯降低，非生物穩(wěn)定提高。但澄清劑法易受用量、酒體成分、pH等因素的影響，而且特異性不強，在去除黃酒渾濁蛋白的同時，也去除了酒體中與渾濁無關的其他蛋白，所以開發(fā)能夠特異性去除二聚-α-淀粉酶抑制劑和類燕麥蛋白的澄清劑品種或者配方是今后的研究方向。

(3)微濾法[6]：微濾法是通過微濾膜兩側的壓力差來篩分溶液中的顆粒和大分子物質，可直接過濾掉黃酒中易形成渾濁的大分子物質。謝廣發(fā)[8]首次將0.8 μm的錯流膜過濾與冷凍處理法相結合，顯著提高了黃酒的非生物穩(wěn)定性。

此外，向酒液中添加酶制劑降解渾濁蛋白的方法在啤酒和葡萄酒中均有應用，此方法可有效提高酒液的蛋白穩(wěn)定性，且蛋白質降解的產物可以作為氮源被酵母吸收利用，例如在葡萄酒中添加AGP(一種曲霉菌肽酶)[42]。另外，還可以通過模擬渾濁蛋白的三維結構，研究其結構特異性，開發(fā)能夠特異性水解這些蛋白質的蛋白酶，以防渾濁的形成[26]。如世界著名的酶制劑公司-荷蘭皇家帝斯曼集團通過研究啤酒渾濁蛋白的結構和組成，從黑曲霉中分離得到了一種能夠特異性降解渾濁蛋白的脯氨酸內切酶，而對啤酒中的其他蛋白特別是泡沫蛋白沒有影響[43]。

3　展望

黃酒因其特有的營養(yǎng)保健功效越來越受到重視。隨著蛋白質組學等技術手段的應用，以及對黃酒蛋白質研究的不斷深入，將會有更多的功能性肽類物質被發(fā)現(xiàn)。同時，隨著渾濁機理研究的進一步深入，黃酒行業(yè)一大難題-蛋白質渾濁，將會得到突破性的進展，最終被徹底解決。

今后，可以從以下幾方面繼續(xù)對黃酒蛋白進行深入研究：

(1)原料糯米中蛋白質提取與種類鑒定，并分析蛋白質的降解情況；

(2)從目前的報道中已知渾濁蛋白質的組成和來源，但對于瓶裝黃酒酒體蛋白的組成尚不清楚。通過蛋白質組學技術分析瓶裝黃酒酒體蛋白的組成，并與渾濁蛋白進行比較，有助于深入分析渾濁蛋白產生的原因；

(3)對各種澄清技術處理前后酒樣中蛋白質種類和數量進行研究，分析各種澄清技術去除的蛋白種類和數量，為工藝生產中的應用提供理論指導；

(4)通過對渾濁蛋白研究分析可知，渾濁蛋白中來源于小麥的二聚α-淀粉酶抑制劑的含量最多，而黃酒釀造過程中小麥中的其他蛋白絕大部分被降解，通過研究二聚α-淀粉酶抑制劑的組成及結構特點，分析其未被蛋白酶降解以及未被其他工藝措施去除的原因，或許可以找到特異性去除黃酒渾濁蛋白的方法；

(5)研究黃酒渾濁中的非蛋白組分，如多糖的種類和數量等，分析這些組分對蛋白質渾濁形成的影響。

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