王俊，滕鈺，周映佑

（貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽550004）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aurues，簡稱S.aurues），是引起細菌性食物中毒的重要病原菌之一，是常見的食源性致病菌之一，當其達到一定數(shù)量后產(chǎn)生的腸毒素會引起食品中毒事件[1-2]。金黃色葡萄球菌檢驗是我國食品衛(wèi)生標準傳統(tǒng)檢測項目，涉及的產(chǎn)品類別多[3]。在GB29921-2013《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》[4]中列明的品種金黃色葡萄球菌檢驗由以前的定性檢測改為定量檢測，對檢驗檢測機構的能力提出了更高的要求。能力驗證能夠確保實驗室維持較高的檢測工作水平，以利于實驗室的自我評定，識別實驗室存在的問題并制定相關的補救措施，對實驗室的質(zhì)量控制及管理起到補充、糾正和完善的作用[5-6]，為了評價和證實實驗室金黃色葡萄球菌定量檢測能力，故本實驗室申請參加了能力驗證活動。通過查閱相關文獻，金黃色葡萄球菌檢測結果不確定度評定的文獻很多[7-10]，但是應用在能力驗證實驗中不確定度評定的文獻沒有，本文嘗試建立能力驗證中金黃色葡萄球菌定量檢測測量不確定度評定的方法。根據(jù)《檢測和校準實驗室能力的通用要求》和《檢測和校準實驗室能力認可準則》中要求對出具檢測結果的實驗室進行不確定度分析[11-12]。對本實驗室參加的能力驗證結果進行不確定度評定，找出影響檢測結果的關鍵環(huán)節(jié)和因素，進行針對性的控制，提高實驗室的檢測水平。建立能力驗證中金黃色葡萄球菌定量檢測測量不確定度評定的方法，為檢測條件相近的實驗室提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1　樣品

來自于中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心。

1.2　儀器設備

ME2002電子天平：梅特勒-托利多；1374A2型生物安全柜：賽默飛世爾儀器有限公司；GR85DA高壓蒸汽滅菌器：致微儀器有限公司；PREV1 COLOR GRAM12自動化革蘭氏染色系統(tǒng)：法國梅里埃；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；BF240電熱恒溫培養(yǎng)箱：德國賓德；KS康氏振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3　培養(yǎng)基

磷酸鹽緩沖液（批號：F1681Y）、Baird-Parker瓊脂平板（批號：G0266Y）、凍干血漿（批號：6103243）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；腦心浸出液肉湯（批號：160728）：北京陸橋技術股份有限公司，按使用說明書配制。

1.4　方法

根據(jù)2017年中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心能力驗證作業(yè)指導書和GB 4789.10-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》第二法金黃色葡萄球菌Baird-Parker平板計數(shù)[13]進行檢測。西林瓶（能力驗證凍干樣品）用40 mL無菌水水化后作為檢測樣品，用25 mL量杯量取25 mL樣品加入到含225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)袋中，充分混勻制備成1∶10（mL/mL）樣品勻液，用1 mL吸管吸取1∶10（mL/mL）的樣品勻液1 mL沿管壁緩慢注入含9 mL磷酸鹽緩沖液的無菌試管中，振搖混勻制備成1∶10（mL/mL）的樣品勻液。同法操作制備10倍系列稀釋樣品勻液。懸著2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別吸取樣品勻液0.3、0.3、0.4 mL接種至3塊Baird-Parker平板，然后用無菌L棒涂布整個平板（不要觸及平板邊緣），于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)（48±2）h，計數(shù)典型菌落數(shù)，選取5個純化后進行革蘭氏染色和血漿凝固酶試驗確認陽性菌落數(shù)。

1.5　結果與報告

根據(jù)Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌的典型菌落數(shù)，報告每毫升樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)，以CFU/mL表示。

2　結果與分析

2.1　建立檢測數(shù)學模型

按1.4進行檢測后，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)計算公式如下：

式中：T為樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)，CFU；A為某一稀釋度典型菌落的總數(shù)，CFU；B為某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)，CFU；C為某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗的菌落數(shù)，CFU；d為稀釋因子。

2.2　不確定度分量的主要來源

根據(jù)實際檢測過程和建立的數(shù)學模型進行分析，樣品中金黃色葡萄球菌定量的不確定度主要來源于：樣品勻液制備過程中引入的不確定度urel（樣品）；稀釋過程中引入的不確定度urel（稀釋）；加樣體積引入的不確定度urel（加樣）；重復檢測引入的不確定度urel（重復）。

2.3　不確定度分量的評定

2.3.1　檢測樣品制備過程中引入的不確定度評定

根據(jù)2017年中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心能力驗證作業(yè)指導書要求，西林瓶（能力驗證凍干樣品）用40 mL無菌水水化后作為檢測樣品，制備過程中使用了A級10 mL量出式分度吸管進行，根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[14]規(guī)定，A級10 mL量出式分度吸管容量允差為±0.05 mL，由于玻璃容器的允差屬于矩形（均勻）分布[15]，故相對標準不確定度為：

2.3.2　稀釋過程中引入的不確定度

第一步1∶10（mL/mL）樣品勻液稀釋時用25 mL的量出式量筒量取25 mL檢測樣品，用250 mL的量杯量取225 mL磷酸鹽緩沖液，根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[10]規(guī)定，25 mL量出式量筒和250 mL量杯的容量允差分別為±0.25 mL和±3.0 mL，由于玻璃容器的允差屬于矩形（均勻）分布[11]，產(chǎn)生的相對標準不確定度分別為：

因此第一步稀釋產(chǎn)生的相對標準不確定度為：urel（稀釋一）

第二步1∶100樣品勻液稀釋時用1 mL的流出式刻度吸管吸取1 mL的1∶10樣品勻液，用10 mL的流出式刻度吸管吸取9 mL磷酸鹽緩沖液，根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[10]規(guī)定，1 mL流出式刻度吸管和10 mL流出式刻度吸管的容量允差分別為±0.008 mL和±0.05 mL，由于玻璃容器的允差屬于矩形（均勻）分布[11]，產(chǎn)生的相對標準不確定度分別為：

因此第二步稀釋產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

一二兩步稀釋產(chǎn)生的合成相對標準不確定度為：

2.3.3　加樣體積引入的不確定度

在金黃色葡萄球菌定量檢測過程中加樣體積是吸取1 mL的樣品勻液以0.3、0.3 mL和0.4 mL的量加入到3個Baird-Parker平板上，使用1 mL的流出式刻度吸管，故加樣體積引入的相對標準不確定度為：

2.3.4　重復檢測引入的不確定度

在相同條件下重復檢測10次，檢測結果見表1。

表1　金黃色葡萄球菌定量檢測結果Table 1　The capability test results of Staphylococcus

用貝塞爾公式計算標準差為：

重復檢測引入的相對標準不確定度為：

2.3.5　合成相對標準不確定度為

2.3.6　評定擴展不確定度

根據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》，置信概率P=95%和自由度γ=10-1=9，由t分布表得到包含因子k=2.26，故擴展不確定度為：

2.3.7　檢測不確定度的結果報告

本次金黃色葡萄球菌定量檢測結果為（18 330±1 025）CFU/mL，包含因子 k=2.26。

3　結論與討論

本實驗室參加的這次能力驗證是由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織實施的，計劃編號為ACAS-PT342，名稱為食品中金黃色葡萄球菌檢測能力驗證，實驗室收到的能力驗證計劃結果通知單的Z值為0.9，結果為滿意（實施方規(guī)定）。

此次試驗主要評定了樣品制備過程、稀釋過程、加樣體積和重復檢測幾個方面引入的不確定度。通過對每個不確定分量的評定結果看，重復檢測引入的不確定度貢獻最大，占主導地位。

實驗室在以后的實驗中應選擇合適的、易行的實驗方案，從環(huán)境、培養(yǎng)基、儀器設備、人員等方面加強質(zhì)量控制，進一步規(guī)范操作，最大限度減小不確定度引入的分量值，從而達到檢測結果的準確性。

參考文獻：

[1]鐘瑋,張寧,劉玉萍,等.食品中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果與分析[J]．食品安全質(zhì)量檢測學報,2016,7(7):2758-2762

[2]陳學強,周浩,劉華等．金黃色葡萄球菌定量檢測人員對比和質(zhì)量控制[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志,2017,27(7):1063-1064

[3]袁平,馬群飛,楊毓環(huán),等.金黃色葡萄球菌定量檢測實驗室間比對結果分析[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012,22(10):2506-2507

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 29921-2013食品安全國家標準,食品中致病菌限量[S].北京:中國標準出版社,2014

[5]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL09:2013檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物領域的應用說明[S].北京:中國標準出版社,2013

[6]趙薇,劉桂華,張煒煜．食品中菌落總數(shù)與金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果與分析[J]．中國衛(wèi)生工程學,2014,13(4):320-322

[7]徐麗萍,商曉春,舒青青．質(zhì)控金黃色葡萄球菌計數(shù)結果不確定度評定[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志,2011,21(3):654-656

[8]沈小芳,張雁,陸永梅．金黃色葡萄球菌計數(shù)結果不確定度評定[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012,22(1):2785-2786

[9]張洪軍,張銘華．食品中金黃色葡萄球菌平板計數(shù)不確定度的評定[J]．微生物學雜志,2013,33(2):39-42

[10]鄧曉鴻,強敏,朱新生,等．食品中致病微生物檢測結果的不確定度評定[J]．食品研究與開發(fā),2016,37(11):160-165

[11]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB/T 27025-2008檢測和校準實驗室能力的通用要求[S].北京:中國標準出版社,2008

[12]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL01:2006檢測和校準實驗室能力認可準則[S].北京:中國計量出版社,2006

[13]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB4789.10-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗[S].北京:中國標準出版社,2010

[14]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJG 196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京:中國計量出版社,2006

[15]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF 1059.1-2012測量不確定度評定與表示[S].北京:中國標準出版社,2012