張穎璐，周敬陽(yáng)，徐倩倩，王穩(wěn)航

（1.天津二商迎賓肉類食品有限公司，天津300000；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

近年來，隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)肉類產(chǎn)品質(zhì)量有了更高的要求。與此同時(shí)，兔肉制品是典型的“四高四低”的保健產(chǎn)品，其具有高賴氨酸、高蛋白、高卵磷脂、高消化率、低膽固醇、低鳥胺、低脂肪、低熱量[1]。逐漸成為消費(fèi)者歡迎的肉制品，全世界的兔肉產(chǎn)量約為200萬噸，我國(guó)是世界上最大的兔肉生產(chǎn)和出口國(guó)，占世界肉類產(chǎn)量的三分之一[2]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)兔肉制品的研究報(bào)道較少，但國(guó)外近年來表現(xiàn)出對(duì)兔肉制品空前的熱情，而相對(duì)的國(guó)內(nèi)的研究又少之又少，這與我國(guó)兔肉生產(chǎn)和出口大國(guó)的身份嚴(yán)重不符[3]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于兔肉產(chǎn)品的研究主要集中在兔肉產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)肌纖維組織、系水力pH值、以及硬度等方面[4-5]。

通常，食鹽添加量、腌制時(shí)間、能夠顯著影響腌漬肉類的色澤[6]。對(duì)于兔肉來說，兔在屠宰后的肉品顏色變化主要集中在45 min到3 h的時(shí)間內(nèi)，3 h到24 h無顯著色澤變化，24 h之后兔肉的色澤基本無變化[7]。目前，超高壓本身作為一種新型現(xiàn)代食品加工技術(shù)，具有滅菌、滅酶，保留產(chǎn)品特色風(fēng)味和色澤，改善肉制品質(zhì)構(gòu)和保水保油性等特點(diǎn)[8]，同時(shí)能夠縮短加工時(shí)間，提高加工效率。通常，當(dāng)超高壓的壓力達(dá)到200kpa～300 kpa時(shí)，肉色澤的亮度會(huì)增大，其與白肌纖維的變化有關(guān)，也有可能肌紅蛋白發(fā)生某些化學(xué)變化所導(dǎo)致的[9]。當(dāng)壓力超過400 kpa時(shí)，色澤中的紅度會(huì)減弱，這是因?yàn)槿庵械膩嗚F肌紅蛋白被氧化成為高鐵肌紅蛋白所造成的。馮哲等研究表明，隨著溫度和壓力的上升，色差L*（亮度）值和△E值（△E=[（△a*）2+（△b*）2+（△L*）2]1/2，其中△a*、△b*、△L* 是與原料肉的 a*（紅綠度）、b*（黃藍(lán)度）、L*的差值）逐漸增加、a*值逐漸下降，豬肉逐漸從鮮紅色變?yōu)榛野咨玔10]。

亞硝酸鹽作為肉制品中常用的發(fā)色劑，但亞硝酸鹽過量會(huì)致癌，亞硝酸鹽含量是我們不得不考慮的一個(gè)重要指標(biāo)。陳建保等研究指出醬腌菜經(jīng)過超高壓滅菌比熱滅菌貯存一段時(shí)間后亞硝酸鹽的殘留量更低[11]。魏永香等采用先腌制再高壓的方法發(fā)明一種具有腸道保健功效的復(fù)合醬菜的制備方法，其亞硝酸鹽顯著降低，接近于不含不含亞硝酸鹽[12]。張隱等將超高壓運(yùn)用到泡椒鳳爪的加工過程，樣品貯藏15天后，亞硝酸鹽含量低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2726-2005《熟肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的最高限定值[13]。

發(fā)酵肉制品指的是利用微生物發(fā)酵將各種酸和醇，并經(jīng)低溫脫水產(chǎn)生的具有特殊風(fēng)味、色澤、質(zhì)地且具有較長(zhǎng)保質(zhì)期的肉制品[14]。在肉制品中添加植物乳桿菌能夠利用其產(chǎn)生的有機(jī)酸，抗生素等物質(zhì)來抑制腐敗菌和致病菌。在肉制品中添加戊糖片球菌可以提高人體對(duì)肉制品的消化吸收，同時(shí)還能起到良好的的抑菌作用，另外還能使肉色更加紅亮，著色效果更加穩(wěn)定。

綜上，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)兔肉制品的色澤的研究主要是其屠宰后的顏色變化，而對(duì)于腌制和超高壓下的色澤變化尚未研究，超高壓對(duì)肉類色澤變化的影響也主要集中于豬肉制品，而對(duì)兔肉鮮有提及。而據(jù)報(bào)道，在對(duì)肉制品進(jìn)行超高壓作用之前對(duì)肉制品進(jìn)行腌制，可有效減弱高壓對(duì)肉類色澤的影響[15]。為此，本文主要通過高壓和腌制的聯(lián)合作用來探究壓力和腌制條件對(duì)兔肉色澤及肌紅蛋白的影響，以為兔肉制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

馬骨骼肌肌紅蛋白：Sigma試劑公司；獺兔，體重2±0.5 kg：天津金元寶農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；植物乳桿菌、戊糖片球菌：天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院；其他試劑均為分析純：天津市江天化工技術(shù)有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

TD6001電子天平：天津天馬衡基儀器有限公司；HPP-L3型超高壓設(shè)備：天津市華泰森淼生物技術(shù)有限公司；紫外可見光全波長(zhǎng)掃描儀：Thermo Fisher科技有限公司；G10型醫(yī)用高速離心機(jī)：河北安新縣白洋離心機(jī)廠；TG328A分析天平：上海天平儀器廠；MOS 450圓二色譜儀：法國(guó)Bio-Logic公司；CIE－LAB全自動(dòng)色差計(jì)：Minolta公司。

1.3　方法

1.3.1　壓力和腌制對(duì)肌紅蛋白的處理

1.3.1.1　肌紅蛋白溶液的制備

將馬骨骼肌肌紅蛋白溶解于pH值為6的磷酸鹽緩沖溶液中，使得肌紅蛋白濃度為20mg/mL，50℃水浴30 min，10 000 r/min離心5 min，最后使肌紅蛋白濃度為2mg/mL之后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2　肌紅蛋白的超高壓處理

將肌紅蛋白樣品分為兩組，兩組均選用0.1、100、200 MPa和400 MPa進(jìn)行超高壓處理。第一組樣品采用先超高壓再腌制的方法進(jìn)行處理，第二組樣品采用先腌制后超高壓的方法進(jìn)行處理，分別測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.1.3　肌紅蛋白色度測(cè)定

使用CIE－LAB全自動(dòng)色差計(jì)參照canto的方法[16]進(jìn)行測(cè)定肌紅蛋白色度。

1.3.1.4　肌紅蛋白圓二色性譜測(cè)定（CD spectrum）

以磷酸緩沖液為對(duì)照樣來測(cè)定處理后的純肌紅蛋白樣品的圓二色性，腌制后的肌紅蛋白樣品以加入與樣品等量的亞硝酸鈉和VC的緩沖液為空白對(duì)照，選擇測(cè)量模式為OD，初始掃描波長(zhǎng)為190 nm，掃描結(jié)束波長(zhǎng)為260 nm，掃描次數(shù)1次，每納米測(cè)量持續(xù)時(shí)間為1 s，CD的靈敏度為300 mdeg，圓二色性用平均殘基橢圓值（θ）來進(jìn)行表示，對(duì)經(jīng)過不同壓力壓力處理的腌制及超高壓順序不同的肌紅蛋白樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2　壓力和腌制對(duì)兔肉的處理

1.3.2.1　發(fā)酵兔肉的腌漬

取獺兔后腿去除可見結(jié)締組織和脂肪的股二頭肌作為肉樣，樣品被分為5組。對(duì)照組：兔肉直接進(jìn)行腌制（輔料配方：兔后腿肉100 g，亞硝酸鹽0.015 g，VC0.03 g，鹽 1.5 g，葡萄糖 2.0 g），低菌組，中菌組，高菌組在腌制的同時(shí)加入植物乳桿菌和戊糖片球菌分別為106、107、108CFU/g。醋酸組：先將兔肉在5%的醋酸中浸泡10 min，取出瀝干然后進(jìn)行腌漬。然后將兔肉隔絕空氣，在25℃條件下保存24 h，60℃干燥6 h。

1.3.2.2　超高壓處理

取切割好的兔肉股二頭肌，大小均勻一致，將兔肉采用與肌紅蛋白的處理方式基本保持一致，不同的是腌制方法按照1.3.2.1中的方法進(jìn)行。最后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2.3　樣品色度的測(cè)定

方法同1.3.1.3。

1.3.2.4　肌紅蛋白含量測(cè)定

采用紫外可見吸收光譜分析法參照LIP等方法[17]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.5　亞硝酸鹽殘留量測(cè)定

參照卞玲娟等[18]中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)中所有測(cè)試均平行檢測(cè)3次，試驗(yàn)結(jié)果表示為什么。數(shù)據(jù)處理與制圖均采用Origin 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件完成。

2　結(jié)果與討論

2.1　壓力和腌制處理對(duì)肌紅蛋白的影響

2.1.1　壓力和腌制對(duì)肌紅蛋白色澤的影響

壓力和腌制處理的肌紅蛋白色度值見表1。

表1　壓力和腌制處理的肌紅蛋白色度值Table 1　Color index of Mb treated with high pressure and curing

由表1可以看出，肌紅蛋白的色澤會(huì)受到腌制和壓力處理先后順序的影響，L*值一直隨著壓力的升高而逐漸增大，但先高壓處理組的增值明顯大于后進(jìn)行高壓處理組的，馬漢軍等研究表明，先進(jìn)行腌制后進(jìn)行超高壓，會(huì)由于腌制形成亞硝基肌紅蛋白從而起到穩(wěn)定色澤的作用[15]。這正與我們的結(jié)果是保持一致的，由于腌制后的肌紅蛋白與亞硝酸鹽發(fā)生反應(yīng)，形成亞硝基肌紅蛋白，從而很好的保護(hù)了肌紅蛋白，進(jìn)而對(duì)色澤起到了良好的保護(hù)作用，肌紅蛋白經(jīng)過腌制處理后由紅色變成了亞硝基肌紅蛋白的粉紅色。100 MPa和200 MPa高壓處理對(duì)色澤的影響不是很明顯，先進(jìn)行400 MPa的超高壓處理會(huì)導(dǎo)致a值的急劇下降，這表明超高壓處理對(duì)色澤的影響較大，但通過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)肌紅蛋白進(jìn)行超高壓處理前先進(jìn)行腌制處理，結(jié)果表明色澤變化顯著低于先高壓后腌制處理組。這更進(jìn)一步的說明先進(jìn)行腌制形成的亞硝基肌紅蛋白能夠有效地降低超高壓對(duì)肌紅蛋白的破壞作用。

2.1.2　壓力和腌制對(duì)肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的影響

壓力和腌制處理的肌紅蛋白圓二色譜圖見圖1。

圖1　壓力和腌制處理的肌紅蛋白圓二色譜圖Fig.1　CD spectra of Mb treated with high pressure and curing

由圖2可知，在222 nm處，每組樣品均出現(xiàn)一個(gè)明顯的負(fù)峰，在圓二色性光譜中222 nm處主要是用來表示α-螺旋的含量，經(jīng)過400 MPa超高壓處理后，在222 nm的負(fù)峰最弱，這表明經(jīng)過400 MPa超高壓處理后，肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋的含量明顯的下降，造成一定程度的解螺旋。進(jìn)而說明了肌紅蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞。同時(shí)我們可以看出，在409 nm處有一個(gè)明顯的正峰，在該處正峰主要是由蛋白質(zhì)輔基引起的。同樣我們可以看到，在400 MPa超高壓處理時(shí)，409 nm處的正峰最弱，進(jìn)一步說明了經(jīng)過超高壓處理后會(huì)造成肌紅蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)的破壞。

2.2　壓力和腌制處理對(duì)發(fā)酵兔肉的影響

2.2.1　壓力和腌制處理對(duì)發(fā)酵兔肉色澤的影響

先經(jīng)過腌制處理的兔肉，再經(jīng)過不同壓力處理10 min后，經(jīng)過不同菌濃度及醋酸組的兔肉的色澤值變化見表2。

表2　壓力和腌制處理后發(fā)酵兔肉色度值Table 2　Color index of rabbit meat treated with high pressure and curing

由表2可以看出，雖然經(jīng)過不同的前處理，但表現(xiàn)出來的趨勢(shì)是相同的，隨著壓力的逐漸升高，L*值逐漸上升，a*值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而值b*未呈現(xiàn)出明顯的變化，這與Shigehisa等[19]研究豬肉的結(jié)果基本一致。

由表2可以看出，在相同的壓力下，后超高壓處理組的樣品組的a*值明顯高于先超高壓處理組樣品的a*值，這與單純處理肌紅蛋白組的結(jié)果是一致的。經(jīng)過腌制處理后，兔肉制品的肌紅蛋白會(huì)與NO結(jié)合形成穩(wěn)定的亞硝基肌紅蛋白，可以避免肌紅蛋白中的二價(jià)鐵離子氧化為三價(jià)鐵離子，由表中還可以看出，經(jīng)過腌制之后，并未顯著影響L*值的變化，這說明腌制并不能影響水分在兔肉表面的附著。肉類食品色澤經(jīng)高壓處理后導(dǎo)致變白的主要是由于高壓導(dǎo)致的球蛋白變性及肌肉失水。通過該實(shí)驗(yàn)的研究，我們也可以看出，超高壓處理后樣品顏色的改變是有多種機(jī)制造成的，有研究表明溫度和壓力的上升均會(huì)造成豬肉L*值的上升，a*值的下降，豬肉最終呈現(xiàn)灰白色[10]。

2.2.2　壓力和腌制處理對(duì)發(fā)酵兔肉肌紅蛋白含量的影響

超高壓和腌制處理后兔肉肌紅蛋白吸收光譜見圖2。

圖2　超高壓和腌制處理后兔肉肌紅蛋白吸收光譜Fig.2　UV/Visual absorption spectra of Mb of rabbit meat treated with high-pressure and curing

如圖2所示，各樣品經(jīng)過不同條件處理后提取的肌紅蛋白的紫外可見吸收光譜，先400 MPa超高壓處理時(shí)顯著地降低其肌紅蛋白的含量，說明超高壓處理確實(shí)能顯著地降低兔肉中肌紅蛋白的含量。由后400 MPa超高壓處理組的樣品作為對(duì)照組可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過腌制處理后，可以顯著地降低壓力對(duì)肌紅蛋白造成的影響，說明壓力并不是能夠絕對(duì)造成肌紅蛋白含量降低的因素。有對(duì)壓力和溫度對(duì)肌紅蛋白含量影響的研究顯示，在不同的高壓下處理豬肉的時(shí)候，不同溫度對(duì)肌紅蛋白含量的影響確是截然不同的[10]。另有張輝等對(duì)生鮮牛肉經(jīng)過超高壓處理工藝研究表明，肌紅蛋白含量的影響因素，處理壓力＞處理時(shí)間＞保壓溫度[20]。

2.2.3　壓力和腌制處理對(duì)發(fā)酵兔肉亞硝酸鹽殘留量的影響

壓力和腌制處理后肉樣亞硝酸鹽殘留量見圖3。

圖3　壓力和腌制處理后肉樣亞硝酸鹽殘留量Fig.3　Nitrite residue of rabbit meat treated with high pressure and curing

如圖3所示，在選用相同的方法進(jìn)行腌制時(shí)，100、200 MPa高壓處理時(shí)，亞硝酸鹽殘留無顯著差異，這與張爽等的研究結(jié)果是一致的[21]。而400 MPa超高壓處理時(shí)，亞硝酸鹽的殘留量顯著增加，后400 MPa超高壓處理時(shí)，亞硝酸鹽殘留量則與對(duì)照組無明顯的差異，據(jù)此我們推測(cè)：未腌制時(shí)，超高壓造成兔肉肌肉組織失水及肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致了亞硝酸與肌紅蛋白反應(yīng)減少，從而造成殘留量較多，而先進(jìn)行腌制再進(jìn)行超高壓處理時(shí)，可能是由于腌制使得兔肉肌紅蛋白與亞硝酸鹽反應(yīng)，生成亞硝基肌紅蛋白較穩(wěn)定，能夠耐受超高壓處理，從而使得亞硝酸鹽殘留量較少。與此同時(shí)，我們可以看出，醋酸組先超高壓處理時(shí)與后超高壓處理時(shí)并未顯示出巨大的差別，這可能是由于醋酸作為廣譜抑菌劑，通過抑制微生物生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制硝酸還原為亞硝酸鹽。

3　結(jié)論

目前國(guó)內(nèi)外，在超高壓對(duì)肉類制品的應(yīng)用方面的研究較少，尤其是涉及兔肉制品就少之又少，超高壓處理會(huì)導(dǎo)致L*值的增大，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的減少，以及肌紅蛋白含量的降低。比較特殊的是，在400 MPa超高壓處理時(shí)，先進(jìn)行腌制后進(jìn)行超高壓處理時(shí)，會(huì)明顯地改善發(fā)色效果，降低α-螺旋的減少量，降低肌紅蛋白的減少量。對(duì)于兔肉樣品，色澤變化與單純的肌紅蛋白基本上保持一致，先腌制后400 MPa超高壓處理同樣顯示出優(yōu)良的效果。超高壓處理無疑會(huì)提高肉類制品的生產(chǎn)效率，經(jīng)過腌制處理有效的避免了超高壓對(duì)兔肉制品帶來的不良影響，這為兔肉制品的加工制造提供了新思路，并有望擴(kuò)大超高壓技術(shù)在肉類行業(yè)的應(yīng)用。

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