陳江曼 李永剛 李新

牙周病是一種牙周組織慢性感染的炎癥性疾病，由革蘭氏陰性厭氧菌引起，其可導(dǎo)致牙齒支持組織的破壞。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）被認(rèn)為是牙周病發(fā)生和疾病進(jìn)展中的主要病原體［1］，可釋放多種致病毒力因子［2］，其中菌毛（Fimbriae，F(xiàn)imA）在粘附到宿主細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)菌的入侵和感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［3］。本研究擬通過基因克隆及重組技術(shù)構(gòu)建P.gingivalisFimA可原核表達(dá)質(zhì)粒，純化FimA融合蛋白，為臨床進(jìn)一步研究P.gingivalis，制備牙周病亞單位疫苗提供部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)株P(guān).gingivalisATCC33277（由中國醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)）；載體 PGEX-6P-1、（E.coil）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ、LA Tap酶及PMD19-T載體（TaKaRa公司，日本）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Axygen公司，美國）；蛋白親和層析GST-SefinoseTMKit（上海生工生物工程有限公司）；異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）等（北京索來寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng)及基因組提取 將－80℃凍存的P.gingivalisATCC33277菌株在室溫解凍，接種于改良的腦心浸出液肉湯（BHI）固體培養(yǎng)基（加入1 mg／L維生素K，1 g／L酵母提取物及5mg／L氯化血紅素）平皿中，37℃厭氧條件下培養(yǎng)4 d，在無菌超凈臺(tái)中刮取表面菌落，接種于BHI液體培養(yǎng)基中，約24 h待細(xì)菌長至對數(shù)期，離心棄上清收集菌體，采用細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒提取P.gingivalis基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增目的基因 根據(jù)GenBank提供的P.gingivalisATCC 33277 FimA序列，運(yùn)用 Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物 F：5′-3′ATTAGGATCCATGGTGGTATTGAAGACCAGC，下 游 引 物 R：5′-3′ATATCTCGAGCCAAGTAGCATTCTGACCAACGAG。采用LA Tap酶進(jìn)行FimA基因擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃變性5 min，94℃30 s、58℃30 s、72℃2 min，共25個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，逐漸降至4℃。PCR產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PGEX-6P-FimA可原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 凝膠電泳分析，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與FimA片段大小一致，切取目的條帶回收純化。將純化的PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體連接過夜，取10μl體系加入200μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42℃熱擊1 min，再冰浴2 min，加入400μl無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃輕搖60 min，取適量混合液涂于含氨芐青霉素（Ampicilin）的LB固體培養(yǎng)基平皿中，37℃過夜。次日，挑取單個(gè)白色菌落，接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖至對數(shù)期，離心棄上清小量提取質(zhì)粒DNA并命名為PMD19-T-FimA。XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至公司測序。分別用XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切測序正確的PMD19-T-FimA質(zhì)粒和空載體PGEX-6P-1質(zhì)粒，回收目的片段。按照片段：載體＝7∶3（質(zhì)量比）對酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，將體系與DH5α感受態(tài)細(xì)胞混勻，按上述方法轉(zhuǎn)化并小量提取質(zhì)粒DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，將重組質(zhì)粒命名為PGEX-6P-FimA。

1.2.4 FimA融合蛋白表達(dá)條件 挑取PGEX-6P-FimA單個(gè)白色菌落接種于30 ml含Ampicilin的LB培養(yǎng)基中，37℃ 180 r／min震蕩，待菌液A值在0.6～0.8之間，分別設(shè)置不同 IPTG誘導(dǎo)濃度（0、0.1、0.3、0.5、0.7、1 mmol／L），不同誘導(dǎo)時(shí)間（4、6、8、12、16 h），在不同溫度下（16、20、25、30、37℃）收集2 ml菌液，4℃8 000 r／min離心10 min，棄上清。用200 μl磷酸緩沖鹽溶液（PBS）充分重懸菌體，冰浴超聲破碎，直至清亮，4℃離心10 min，分別收集上清及沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測最適誘導(dǎo)條件。

1.2.5 FimA融合蛋白大量表達(dá)及純化 通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比，在16℃，IPTG濃度為1 mmol／L條件下，誘導(dǎo)600 ml A600為0.74的菌液12 h，4℃離心棄上清，用20 ml PBS重懸菌體，按1∶100的比例加入200 μl苯甲基磺酰氟（PMSF），冰浴超聲直至清亮，4℃8 000 r／min離心30 min，棄上清，用 20 ml GuMCAC-0（20 mmol／L Na3PO3·12H2O，0.5 mmol／L NaCl，6 mmol／L鹽酸胍，pH7.9）充分溶解，4℃過夜。次日，4℃4 000 r／min離心30 min，收集油性上清加入至超濾離心管中，4℃4 000 r／min離心，并逐漸用不含咪唑的 MCAC-0緩沖液（20 mmol／L Na3PO3·12H2O，0.5 mmol／L NaCl，pH7.9）置換，待液體清亮后，將液體加入到GST凝膠層析柱中，控制流速緩慢過柱，抽提／平衡緩沖液（140 mmol／L NaCl，10 mmol／L Na2HPO4，1.8 mmol／L K2HPO4，pH7.5）流洗凝膠，直至無蛋白流出。最后用5～10倍凝膠體積的洗脫緩沖液（50 mmol／L Tris-HCl，33 mmol／L Glutathione，pH8.0）進(jìn)行洗脫并收集液體，－80℃保存。

1.2.6 FimA融合蛋白鑒定 取少量洗脫液制樣行SDS-PAGE電泳，切取凝膠15 V，20 min半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PDVF膜），于室溫用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST緩沖液稍加浸洗后將膜放入1∶2 500稀釋的GST抗體中，搖床4℃過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色液檢測。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增FimA基因

小量提取的細(xì)菌 DAN濃度為0.125μg／μl，A260nm／A280nm＝1.85，說明DAN純度較好，無RNA酶污染。用提取的DNA為模板，LA Tap酶擴(kuò)增目的基因，電泳顯示在1 000 bp處有一特異性條帶與FimA大?。? 044 bp）一致（圖 1）。

圖1 LA Tap酶擴(kuò)增FimA基因Fig 1 LA Taq enzyme amplified FimA gene

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

將PMD19-T-FimA質(zhì)粒和空載體PGEX-6P-1進(jìn)行XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切，回收目的片段并連接，雙酶切驗(yàn)證。電泳顯示有和預(yù)期大小一致的酶切片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為PGEX-6P-FimA（圖2～4）。

2.3 FimA融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒PGEX-6P-FimA在大腸桿菌中少量表達(dá)，經(jīng)過不同誘導(dǎo)條件，超聲裂解各菌體，收集上清及沉淀，SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)檢測各條件下是否釋放蛋白及蛋白存在形式。結(jié)果顯示，在16℃，IPTG濃度為1 mmol／L，誘導(dǎo)12 h時(shí)蛋白量最多，且主要以包涵體形式存在（圖5）。

圖2 XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切PMD19-T-FimA質(zhì)粒Fig 2 The XhoⅠ／BamHⅠ digested plasmid PMD19-T-FimA

圖3 XhoⅠ／BamHⅠ雙酶切載體PGEX-6P-1質(zhì)粒Fig 3 The XhoⅠ／BamHⅠ digested plasmid PGEX-6P-1

圖4 XhoⅠ／Bam4HⅠ雙酶切PGEX-6P-FimA質(zhì)粒Fig 4 The XhoⅠ／BamHⅠ digested plasmid PGEX-6P-FimA

2.4 FimA融合蛋白純化及鑒定

在最適條件下大量誘導(dǎo)FimA融合蛋白，通過對包涵體變性和梯度復(fù)性，4℃條件下與谷胱甘肽－瓊脂糖介質(zhì)結(jié)合，經(jīng)過流洗雜蛋白、洗脫等步驟，收集純化的FimA融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。如圖6得到了純度較好的FimA融合蛋白，在約60 000處有一明顯特異性條帶，與融合蛋白大小預(yù)期相符（圖7）。

圖5 最適誘導(dǎo)條件Fig 5 Optimum inducing condition

圖6 洗脫蛋白Fig 6 Elution protein

3 討 論

口腔內(nèi)特有的環(huán)境利于細(xì)菌的生長和繁殖，細(xì)菌的存在易刺激牙菌斑的形成，牙菌斑長期累積在硬組織和軟組織上則形成牙結(jié)石。雖然細(xì)菌的定居與侵入?yún)^(qū)域受到牙菌斑細(xì)菌和宿主先天防御機(jī)制之間的共同控制［4］，大多處于動(dòng)態(tài)平衡，但是當(dāng)菌塊延伸至齦下時(shí)可觸發(fā)免疫系統(tǒng)失衡［5］。目前，我國慢性牙周病發(fā)病率高達(dá)85%以上，是導(dǎo)致成年人牙齒喪失最主要的原因［6－8］，同時(shí)牙周病也可對其它全身疾病起到促進(jìn)作用，甚至對個(gè)人生活質(zhì)量及社會(huì)工作造成很大的影響［9－12］。

雖然臨床治療可以將受損的牙周組織恢復(fù)到原始形態(tài)，但其病變區(qū)域極易受到細(xì)菌的連續(xù)侵襲，可再次誘發(fā)牙周病的發(fā)生，因此應(yīng)該針對疾病預(yù)防建立有效的牙周保健系統(tǒng)［13］。研究開發(fā)針對牙周病細(xì)菌的疫苗一直是牙周病治療的輔助方向之一。在動(dòng)物牙周病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，用滅活的P.gingivalis全細(xì)胞免疫發(fā)現(xiàn)可以減少該菌在齦下的數(shù)量并可減輕牙槽骨的吸收程度［14］，這提示疫苗可能成為預(yù)防和治療牙周病的有效措施。

本實(shí)驗(yàn)旨通過目的基因克隆及構(gòu)建可原核表達(dá)質(zhì)粒，純化帶有GST標(biāo)簽的FimA融合蛋白。GST標(biāo)簽為谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽，其轉(zhuǎn)移酶可與底物特異性結(jié)合，同時(shí)GST標(biāo)簽有高特異性，能較好的保留蛋白的抗原性和生物活性。在實(shí)驗(yàn)過程中IPTG濃度、時(shí)間及溫度的變化都會(huì)影響融合蛋白的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過多次誘導(dǎo)表達(dá)顯示，融合蛋白主要以包涵體形式存在，在16℃，IPTG濃度為1 mmol／L，誘導(dǎo)12 h時(shí)蛋白表達(dá)量最多，值得注意的是，GST標(biāo)簽包涵體蛋白需要經(jīng)過變性及梯度復(fù)性才能較好的與谷胱甘肽結(jié)合。經(jīng)過SDS-PAGE和Western blot檢測，在約60 000 bp處顯示出特異性條帶，與預(yù)期蛋白大小相符。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)純化出了特異性較高的FimA融合蛋白，為后續(xù)制備多克隆抗體，進(jìn)一步研究FimA特性和在牙周病發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床牙周病亞單位疫苗的研制提供了部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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