馬鈺泱，狄澤敏，曹　晴，沈玉君，沈玉先，馮利杰

( 安徽醫(yī)科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2. 生物藥物研究所, 安徽 合肥　230032 )

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀硇宰陨砻庖咝约膊　Ｆ洳±硖攸c(diǎn)為關(guān)節(jié)滑膜病變，包括滑膜細(xì)胞過度增生，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成，關(guān)節(jié)骨和軟骨破壞等，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)和關(guān)節(jié)囊的破壞，關(guān)節(jié)強(qiáng)直畸形，失去原有的功能，嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量[1-2]。RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今未有定論。深入探討RA的發(fā)病機(jī)制，可為其臨床診斷和治療提供新思路和新靶標(biāo)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)應(yīng)激是指在缺氧、氧化應(yīng)激、鈣平衡失調(diào)等情況下，ER內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白明顯增多，一旦超出ER的負(fù)荷能力，細(xì)胞會(huì)激活相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來恢復(fù)ER內(nèi)正常的蛋白折疊環(huán)境[3-4]。已有研究報(bào)道，ER應(yīng)激參與了RA的病理過程[5]。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte- derived neurotrophic factor, MANF)基因是我們通過微陣列(microarray)技術(shù)，從30000個(gè)基因中篩選出的對(duì)ER應(yīng)激最敏感的基因[6]，其編碼的MANF蛋白是一個(gè)分泌蛋白，ER應(yīng)激可上調(diào)其表達(dá)和分泌[7]。為了了解MANF在RA中的表達(dá)情況，我們以佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠為疾病模型，檢測(cè)致炎后不同時(shí)期大鼠關(guān)節(jié)滑膜中MANF和ER應(yīng)激標(biāo)志蛋白BiP和CHOP的表達(dá)，以及血清中MANF和急性期反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1 β, IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)的水平；分析MANF表達(dá)與關(guān)節(jié)炎癥狀、CRP、IL-1β和TNF-α的相關(guān)性，探討MANF在關(guān)節(jié)炎癥中可能發(fā)揮的作用。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200±20)g，共50只，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2試劑弗氏完全佐劑(Freund complete adjuvant, FCA)購(gòu)自Sigma公司；蘇木精和伊紅購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；IL-1β、TNF-α的ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；CRP的ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司；MANF的ELISA試劑盒由本實(shí)驗(yàn)室制備[8]；ECL顯色試劑盒購(gòu)自Pierce公司；MANF單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備[9]；兔抗BiP多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗CHOP多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的GAPDH抗體購(gòu)自上海康成生物工程有限公司。

1.1.3儀器YLS2TA足爪容積測(cè)量?jī)x(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)；Electron Px2型PCR儀(美國(guó)Thermo公司)；JY92-ⅡD型超聲波粉碎機(jī)(寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(珠海Hema公司)。

1.2　方法

1.2.1大鼠AA模型的建立50只SD大鼠，隨機(jī)分為正常組和模型組，其中正常組10只，模型組40只。常規(guī)消毒大鼠左后側(cè)足趾，模型組大鼠左后足跖皮內(nèi)注射1 g·L-1的FCA 0.1 mL致炎，正常對(duì)照組大鼠于相同部位注射等量生理鹽水，此后每天觀察大鼠的活動(dòng)及關(guān)節(jié)腫脹情況。

1.2.2關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定致炎前(d 0)和致炎后d 7、14、21、28，用足爪容積測(cè)量?jī)x測(cè)定大鼠右后側(cè)(非致炎側(cè))足容積，求出關(guān)節(jié)腫脹度(△mL=致炎后容積-致炎前容積)，以評(píng)價(jià)AA大鼠關(guān)節(jié)繼發(fā)炎癥變化。

1.2.3多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, AI)評(píng)分采用AI評(píng)分評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)展及嚴(yán)重程度。AI分為5分，0分：無紅腫；1分：趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。根據(jù)未注射佐劑的3個(gè)肢體的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算出AI。

1.2.4HE染色大鼠造模3周后處死，取膝關(guān)節(jié)，用質(zhì)量濃度40 g·L-1的多聚甲醛室溫固定3 d，質(zhì)量濃度100 g·L-1的EDTA室溫脫鈣4周，之后常規(guī)制備石蠟切片，切片厚度為5 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色5 min，體積分?jǐn)?shù)0.1的鹽酸乙醇分色3 s，伊紅染色5 min，常規(guī)脫水后二甲苯透明20 min，中性樹膠封片。

1.2.5Western blot取正常以及致炎后d 2、7、14、21、28大鼠繼發(fā)側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織充分裂解，100℃變性10 min，SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜， 用含0.5 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉30 min后，加入適當(dāng)稀釋度的一抗4℃孵育過夜，PBST洗10 min×3次后，加入適當(dāng)稀釋度的二抗室溫孵育1 h，PBST洗10 min×3次后，ECL顯影。

1.2.6逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)取正常和致炎后d 2、7、14、21、28大鼠繼發(fā)側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，提取RNA后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積20 μL，cDNA模板1 μL，引物(10 mol·L-1)1 μL，2×Premix Extaq 10 μL，去RNase無菌水8 μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，55℃(BiP、MANF、β-actin)或58℃(CHOP)退火60 s，72℃延伸60 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。BiP引物：上游5′-GGTATTG AAACTGTGGGAGG-3′，下游5′-TTGTCTTCAGCTGTCACTCG-3′；CHOP引物：上游5′-GGAGCTGGAAGCCTGGTATGA-3′，下游5′-TCCCTGGTCAGGCGC TCGATTT-3′；MANF引物：上游5′-TCCGCTACT GTAAGCAAGGT- 3′，下游5′-CT TCACCTAGGATCTTGGTG-3′；β-actin引物：上游5′-TCACCAACTGGGACGACAT-3′，下游5′-GCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。

1.2.7ELISA檢測(cè)取正常和致炎后d 2、7、14、21、28大鼠血清，分別采用MANF、CRP、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒，按說明書操作。用Curve Expert軟件進(jìn)行計(jì)算。

2　結(jié)果

2.1AA大鼠模型評(píng)價(jià)致炎后d 1注射足爪明顯紅腫，持續(xù)3 d后，逐漸減輕；致炎后d 12左右，非致炎右后足出現(xiàn)腫脹，開始主要表現(xiàn)在踝關(guān)節(jié)，逐漸累及整個(gè)腳趾，腳趾關(guān)節(jié)間及前足跖出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大，局部皮膚充血、紅腫，d 21左右達(dá)到高峰，隨后逐漸減輕。在致炎后d 7、14、21、28分別測(cè)量大鼠右后側(cè)足容積。與正常對(duì)照組相比，致炎后d 14開始，AA大鼠的繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹度明顯增加，d 21左右達(dá)到高峰，隨后稍有下降，一直持續(xù)到d 28(Tab 1)；AI評(píng)分顯示，致炎后d 14左右，AA大鼠開始出現(xiàn)全身癥狀，表現(xiàn)為未注射CFA的其余3個(gè)肢體關(guān)節(jié)紅腫、變形，耳部及尾部結(jié)節(jié)，行走不便，消瘦等，AI評(píng)分明顯升高，致炎后d 21 AI評(píng)分達(dá)到高峰并維持至d 28(Fig 1)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明AA大鼠模型成功。

Fig 1　Change of arthritis index of AA rats (±s, n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsd 7

Tab 1　The paw swelling in secondaryinflammation of AA rats (±s, n=6)

**P<0.01vsnormal group

2.2AA大鼠膝關(guān)節(jié)病理改變HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊的滑膜細(xì)胞僅有2～3層，排列規(guī)則，滑膜組織無血管增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)(Fig 2A)；AA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜襯里層增厚，滑膜組織呈絨毛狀或指狀肥大，伸入到關(guān)節(jié)腔內(nèi)，滑膜組織內(nèi)可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管壁及其周圍區(qū)域炎細(xì)胞浸潤(rùn)尤為明顯。新生血管形成，關(guān)節(jié)軟骨表面可見剝脫、缺損(Fig 2B)。

Fig 2　Histopathology of knee joint in normal and AA rats (scale bar=100 μm)

A: In normal control rats, synoviocytes were monolayer (A1) and articular cartilages were normal (A2); B: 21 days after FCA injection, synoviocytes proliferated three to six layers, inflammatory cells infiltrated into synovium, and pannus was formed (B1, B2), destruction of articular cartilages (B1, B3) and extensive newborn vessels (B4) were present in the hyperplastic synovium of the AA knee (arrows).

2.3AA大鼠炎癥不同時(shí)期滑膜組織MANF、BiP和CHOP的表達(dá)取正常和致炎后d 2、7、14、21、28大鼠繼發(fā)側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，分別提取RNA和蛋白，采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)MANF、BiP、CHOP的mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示，MANF蛋白水平在致炎后d 2～7緩慢升高，d 14左右達(dá)到峰值，隨后緩慢下降，d 28仍高于正常水平；ER應(yīng)激蛋白BiP在致炎后d 2明顯上調(diào)，隨后略有下降，但仍維持較高水平；而CHOP則一直維持在低水平緩慢上升的狀態(tài)(Fig 3B)；RT-PCR結(jié)果也顯示，相似的表達(dá)趨勢(shì)(Fig 3A)，提示關(guān)節(jié)炎癥能誘導(dǎo)ER應(yīng)激和MANF表達(dá)。

2.4AA大鼠血清中MANF水平及其與關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析收集正常和致炎后d 2、7、14、21、28大鼠血清，ELISA檢測(cè)MANF水平。結(jié)果顯示，與正常組相比，致炎后d 2血清中MANF水平開始明顯升高，d 14達(dá)到峰值，d 21開始下降，d 28仍高于正常水平(Tab 2)。為了進(jìn)一步研究血清中MANF水平與關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性，我們將致炎后不同時(shí)期血清中MANF水平與關(guān)節(jié)腫脹度和AI評(píng)分進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在繼發(fā)性反應(yīng)期，AA大鼠血清中MANF水平與二者均存在負(fù)相關(guān)，與關(guān)節(jié)腫脹度的相關(guān)系數(shù)為0.939 4，與AI評(píng)分的相關(guān)系數(shù)為0.954 1(Fig 4)。

Tab 2　Levels of MANF, CRP, IL-1β and TNF-α in bloodserum of AA rats at different phases (±s, n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsd 0

2.5AA大鼠血清中MANF水平與CRP的相關(guān)性分析ELISA檢測(cè)正常和致炎d 2、7、14、21、28大鼠血清CRP的水平(Tab 2)，結(jié)果顯示，與MANF相似的變化趨勢(shì)；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MANF和CRP有著明顯的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.943 3(Fig 4)。

2.6AA大鼠血清中MANF水平與IL-1β、TNF-α的相關(guān)性分析為了進(jìn)一步研究血清中MANF水平與炎癥因子的關(guān)系，我們檢測(cè)了致炎不同時(shí)期血清中IL-1β和TNF-α的水平。ELISA結(jié)果顯示，IL-1β在致炎后d 21明顯增高，TNF-α在致炎d 2明顯增高，到d 21～28趨于平緩(Tab 2、Fig 4)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在繼發(fā)性反應(yīng)期，血清MANF水平與IL-1β和TNF-α呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.900 4和0.938 1(Fig 5)。

Fig 3　Expressions of MANF, BiP and CHOP in synovium during course of AA

A: The mRNA levels of MANF, BiP and CHOP in synovium; B: The quantitative data in A were normalized by β-actin; C: The protein levels of MANF, BiP and CHOP in synovium; D: The quantitative data in C were normalized by GAPDH. Error bars represent data from three independent experiments.*P<0.05,**P<0.01vsd 0.

3　討論

AA模型一般分為兩個(gè)時(shí)相，即原發(fā)性反應(yīng)期和繼發(fā)性反應(yīng)期。原發(fā)病變屬急性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為致炎側(cè)的關(guān)節(jié)、足跖紅腫，致敏后即可出現(xiàn)，18～24 h達(dá)峰值，持續(xù)3～5 d后逐漸減輕；而繼發(fā)性反應(yīng)則是機(jī)體免疫功能紊亂所造成的免疫性炎癥表現(xiàn)，表現(xiàn)為造模后10 d左右再度出現(xiàn)的致炎側(cè)、非致炎側(cè)及雙前肢的關(guān)節(jié)和足趾腫脹，耳、尾關(guān)節(jié)炎結(jié)節(jié)，以及體重下降等全身變化；與人類RA近似。RA的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未明確。已有研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜細(xì)胞核內(nèi)有ER定位的轉(zhuǎn)錄因子ATF6的激活[10]。ER應(yīng)激標(biāo)志蛋白BiP在RA滑膜組織中高表達(dá)，80% RA患者血清中存在抗BiP抗體[11]。外源性的重組人BiP能促進(jìn)外周血單核細(xì)胞中抗炎因子IL-10的表達(dá)，抑制TNF-α表達(dá)，從而抑制炎癥。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，BiP在兔免疫性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中表達(dá)上調(diào)[12]。本研究中我們進(jìn)一步觀察了BiP在AA大鼠不同階段的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BiP在AA大鼠急性炎癥期(d 2)表達(dá)明顯升高，此后一直維持較高的水平。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，我們推斷BiP可能具有抑制炎癥的作用，那么如何解釋在BiP表達(dá)上調(diào)以及ER應(yīng)激激活的情況下，炎性滑膜細(xì)胞仍然處于高度增殖的狀態(tài)？我們推測(cè)，RA中是否還存在其他調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡平衡的因素存在，從而影響滑膜細(xì)胞的功能。因此，我們檢測(cè)了CHOP表達(dá)。CHOP屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族的凋亡前因子，在ER應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起著主導(dǎo)作用，也是公認(rèn)的ER應(yīng)激標(biāo)志蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，AA進(jìn)程中CHOP水平一直維持在緩慢上升的狀態(tài)。CHOP在AA中持續(xù)低水平狀態(tài)也進(jìn)一步證明了滑膜細(xì)胞的異常增殖可能與ER應(yīng)激狀態(tài)下增殖與凋亡失衡有關(guān)。

Fig 4　Correlation between serum MANF level with arthritis symptoms and CRP level in AA rats

A: Correlation analysis of serum MANF level with swell of hind paw in the secondary inflammatory period of AA rats; B: Correlation analysis between serum MANF level with arthritis index in the secondary inflammatory period; C: Correlation analysis between MANF with CRP levels in serum in the secondary inflammatory period of AA rats.

Fig 5　Relationship between MANF levels and IL-1β(A) or TNF-α(B) in serum of AA rats

MANF基因是我們從30 000個(gè)基因中篩選出的對(duì)ER應(yīng)激最敏感的基因，在ER應(yīng)激時(shí)其mRNA水平被上調(diào)8倍以上[6]，我們推測(cè)MANF作為ER應(yīng)激敏感基因，可能參與了關(guān)節(jié)炎癥誘導(dǎo)ER應(yīng)激的過程。本研究發(fā)現(xiàn)，正常滑膜組織中MANF僅有少量表達(dá)，可能用于維持正?；すδ?，而致炎后d 2 MANF表達(dá)略有升高，到d 14左右MANF表達(dá)明顯升高，隨后逐漸下降，因此，我們認(rèn)為MANF參與了AA炎癥反應(yīng)的全過程，且其對(duì)繼發(fā)性炎癥刺激的敏感程度高于BiP和CHOP。

MANF是一個(gè)分泌蛋白，ER應(yīng)激能上調(diào)其表達(dá)和分泌。那么關(guān)節(jié)炎癥能否誘導(dǎo)MANF分泌增加？我們發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，AA大鼠血清中MANF水平明顯升高，在繼發(fā)性反應(yīng)初期達(dá)到峰值，隨后有下降趨勢(shì)，直到炎癥消退時(shí)，其水平仍高于正常水平，提示AA炎癥能誘導(dǎo)MANF分泌，并且MANF對(duì)繼發(fā)性炎癥刺激較為敏感。CRP是RA臨床實(shí)驗(yàn)室檢查的重要項(xiàng)目，CRP與RA的活動(dòng)程度、骨質(zhì)破壞程度及受累關(guān)節(jié)數(shù)相關(guān)，在RA活動(dòng)期，CRP明顯升高，與血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)升高相平行，但比ESR升高出現(xiàn)的早，消失的也快，是反映炎癥活動(dòng)程度和治療效果的良好指標(biāo)[13]。我們的結(jié)果顯示，AA大鼠血清CRP水平與MANF的升高水平呈正相關(guān)，因此，血清中MANF水平也可考慮作為RA臨床早期診斷和評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)性的新指標(biāo)。

本研究還進(jìn)一步分析了AA大鼠外周血中MANF水平與繼發(fā)性反應(yīng)期足爪腫脹度、AI評(píng)分及血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在繼發(fā)性反應(yīng)期，外周血MANF水平與AA癥狀、TNF-α和IL-1β之間存在負(fù)相關(guān)。目前已有報(bào)道MANF能通過抑制NF-κB活性、調(diào)控p38 MAPK通路，抑制炎癥[14-15]，因此，AA中MANF的表達(dá)和分泌可能與繼發(fā)性炎癥進(jìn)展密切相關(guān)。

綜上所述，AA炎癥伴隨著ER應(yīng)激，而MANF作為ER應(yīng)激敏感蛋白，在AA中表達(dá)上調(diào)，尤其是在繼發(fā)性反應(yīng)初期；同時(shí)AA能誘導(dǎo)MANF分泌增加，血清MANF水平可考慮作為臨床早期診斷和評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)性的新指標(biāo)。通過MANF水平與關(guān)節(jié)繼發(fā)性炎癥及血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β之間的相關(guān)性分析，我們推測(cè)MANF的表達(dá)與RA的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在安徽醫(yī)科大學(xué)科教大樓生物藥物研究所完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師與同學(xué)的幫助。)

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