潮　蓉，武小娟，王羽輝，蘇倩倩 ，呂雄文

(1. 安徽醫(yī)科大學藥學院，安徽 合肥　230032；2. 安徽省胸科醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥　230022)

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于長期、大量飲酒引起的肝臟的損害，其發(fā)展過程為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化。目前，我國ALD的發(fā)病率逐漸增加，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大病因[1]。因此，治療酒精性肝損傷受到日益廣泛的關注。

嘌呤受體 P2X7(purinergic 2X7 receptor, P2X7R)是一種離子型配體門控通道受體，由配體ATP激活后，可使離子通道開放，促進Ca2+、Na+內(nèi)流以及K+外流，進而介導一系列細胞信號轉(zhuǎn)導，如可激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NACHT-LRR-PYD-containing proteins 3 inflammasome, NLRP3)，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)等多條通路，誘導成熟白細胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白細胞介素18(interleukin 18, IL-18)等細胞因子的成熟和釋放[2]，在炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)中起著非常重要作用。研究表明，ATP-P2X7R是激活NLRP3的一條重要信號通路，NLRP3炎性體的活化主要通過分泌IL-1β、IL-18發(fā)揮下游效應[3]。已有報道，IL-1β促進慢性肝損傷[4]，IL-18也被發(fā)現(xiàn)參與肝細胞的損傷[5]，由此推測，P2X7R可能通過激活NLRP3引起肝細胞損傷。為了探討P2X7受體及其介導的NLRP3炎性體信號通路在酒精誘導的肝損傷中的作用，本實驗應用C57BL/6小鼠制備急性酒精肝模型，通過使用P2X7特異性阻斷劑A438079干預模型動物，觀察抑制P2X7R對肝損傷的影響，并探討P2X7R-NLRP3信號通路在酒精性肝損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物8～10周齡C57BL/6小鼠，♂，體質(zhì)量(23±3)g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級動物房，室溫(18～23) ℃，濕度為40%～60%，每籠2只。

1.1.2試劑P2X7抗體(美國Santa Cruz公司)，A438079(美國TOCRIS公司)，NLRP3抗體、ASC抗體、IL-1β、IL-18(北京博奧森公司)，ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)。

1.1.3儀器DL-5M高速冷凍離心機(德國saftarius公司)，DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)，LD4-2型低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，XW-80A微型旋渦混合儀(上海瀘西分析儀器廠有限公司)。

1.1　方法

1.2.1小鼠急性酒精性肝損傷模型建立建立30只♂ C57BL/6小鼠，隨機分為3組(n=10)：對照組、模型組、A438079組。采用美國國立衛(wèi)生院酒精濫用與酒精中毒研究所(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, NIAAA)肝病研究室建立ALD模型的方法建立小鼠急性酒精性肝損傷模型[6]，造模過程包括適應期5 d、造模期10 d、灌胃1次、取標本1 d，總計需16 d。d 1、2，對照組、模型組、A438079組喂對照液體飼料；d 3對照組喂對照液體飼料，模型組、A438079組喂2/3對照液體飼料+1/3酒精液體飼料；d 4對照組喂對照液體飼料，模型組、A438079組喂1/3對照液體飼料+2/3酒精液體飼料；d 5對照組喂對照液體飼料，模型組、A438079組 喂酒精液體飼料；d 6～15對照組喂對照液體飼料，模型組、A438079組喂酒精液體飼料；最后1周，分組進行以下處理[7]，對照組和模型組：給予等劑量的生理鹽水腹腔注射(每只約0.2 mL)，每日1次；A438079組：根據(jù)小鼠體質(zhì)量，腹腔注射200 μmol·kg-1[8]的A438079(按7 g·L-1配制A438079，每只約0.2 mL)，每日1次。最后1天清晨給予單次31.5%酒精溶液灌胃，劑量為10 mL·kg-1。禁食9 h后，每組隨機抽取6只小鼠眼眶取血并剖腹取肝，血清用于檢測測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase ，AST)、膽固醇(cholesterol ，TCHO)、甘油三酯(triglyceride ，TG)的水平，肝組織用于組織病理的觀察和免疫組化分析。

1.2.2生化指標的檢測取血后，按照試劑盒說明書操作，采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清ALT、AST、TCHO和TG。

1.2.3組織病理學檢查將肝組織固定于福爾馬林中，再流水沖洗過夜，經(jīng)過脫水包埋，制成石蠟組織塊，再進行組織切片，脫蠟水化、染色，最后進行脫水、透明、封片、拍照。通過HE染色觀察肝組織的損傷情況。

1.2.4免疫組織化學分析制備肝臟石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS沖洗，3% H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗，抗原修復10 min，蒸餾水洗，PBS洗，正常山羊血清封閉10 min，加入一抗，4℃過夜，37℃孵育20 min，PBS沖洗，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，加入SP復合物孵育20 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。采集高倍視野(×200倍)圖像，Imagine-Pro-Plus軟件分析，分別對各組小鼠肝組織切片的免疫組化染色的陽性表達進行定量分析，測定組織中蛋白染色平均光密度值并分析，染色越深，反映蛋白的表達越高。

1.2.5Western blot法檢測肝組織中的P2X7、NLRP3、ASC、IL-1β、IL-18蛋白的表達水平取各組小鼠的肝組織樣品制成肝勻漿，加含有10 μL PMSF的1 mL RIPA裂解液，置冰浴中裂解30 min；4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，取上清，用BCA試劑盒定量，加入蛋白上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性。每孔上樣10 μL總蛋白，進行SDS-PAGE凝膠電泳，先在80 V恒壓下電泳，待染料進入分離膠后增至120 V，電泳至染料離開分離膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜放入10 mL封閉液(5%脫脂奶粉溶于TBST)封閉3 h。膜用TBST清洗3次，每次10 min，加入預先配好的一抗中4℃孵育過夜。再分別加入與一抗相對應的二抗，室溫下孵育1 h，配制顯色液，進行化學發(fā)光拍照。

2　結(jié)果

2.1P2X7特異性阻斷劑對模型小鼠肝功能的影響Tab 1結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、TCHO、TG明顯升高(P<0.01)，表明急性酒精性肝損傷模型成立。與模型組相比，P2X7特異性阻斷劑A438079組小鼠血清ALT、AST、TCHO、TG明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明A438079可減輕酒精所致的小鼠的肝損傷。

Tab 1　Comparison of serum ALT, AST, TCHO, TG content in each group(±s, n=5)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

2.2P2X7特異性阻斷劑對模型小鼠肝臟組織病理的影響為觀察肝組織中的病理損傷，我們進行了病理切片和HE染色檢測。Fig 1結(jié)果表明，正常組小鼠肝臟未見明顯病變，模型組小鼠肝細胞可見明顯脂肪變性，肝細胞腫脹明顯，肝索排列紊亂。

Fig 1　Pathological changes of liver tissues in mice (×200)

A: Control; B: Model; C: A438079

Fig 2　Expression of P2X7 in liver tissues of mice in each group (×200)

A: Control; B: Model; C: A438079; D: Immunohistochemical P2X7 protein optical density ratio analysis results.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group

P2X7特異性阻斷劑A438079組肝臟脂肪變性明顯減少。說明A438079可以有效的抑制酒精誘導的肝臟組織病理損傷。

2.3P2X7特異性阻斷劑對模型小鼠肝臟中P2X7R表達的影響用免疫組化染色測定P2X7特異性阻斷劑對模型小鼠肝臟中P2X7R表達的影響，采集高倍視野圖像，測定肝臟組織中P2X7R蛋白染色平均光密度值，進行半定量分析。Fig 2結(jié)果顯示，P2X7R細胞染色呈黃色或棕黃色為陽性，定位于細胞質(zhì)。與正常對照組比較，模型組小鼠肝臟組織P2X7R蛋白表達明顯升高；與模型組相比，A438079組小鼠肝臟組織P2X7R蛋白表達明顯降低。

2.4酒精性肝損傷模型以及P2X7特異性阻斷劑對小鼠肝組織中P2X7、NLRP3、ASC表達的影響Fig 3結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組P2X7、NLRP3、ASC蛋白的表達明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，A438079組P2X7、NLRP3、ASC蛋白的表達明顯降低(P<0.01)。

2.5酒精性肝損傷模型以及P2X7特異性阻斷劑對小鼠肝組織中IL-1β、IL-18表達的影響Fig 4結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組IL-1β、IL-18的表達明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，A438079組IL-1β、IL-18的表達明顯降低(P<0.01)。

Fig 3　Expression of P2X7, NLRP3, ASC in liver tissues of mice

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group

Fig 4　Expression of IL-1β, IL-18 in liver tissues of mice

##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group

3　討論

ALD的疾病缺乏針對性的治療方法，ALD研究更接近人類ALD的動物模型，研究其發(fā)病機制具有非常重要的意義。有文獻總結(jié)了不同動物模型模擬ALD病變情況[9]，總結(jié)了各種模型的優(yōu)缺點，綜合各種因素，本實驗選擇了Gao-binge模型，可模擬人ALD的發(fā)病過程。采用NIAAA法建立酒精性肝損傷小鼠模型，經(jīng)模型組與對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST明顯升高，提示造模成功。

肝臟是酒精代謝的主要臟器，長期、大量的飲酒會引起肝臟損傷，酒精導致肝損傷的機制復雜，目前認為主要有以下幾種學說：內(nèi)毒素、氧化應激和炎癥反應；其中炎癥反應在ALD的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關鍵性的作用[10]。在酒精的刺激下，肝臟內(nèi)被激活的的巨噬細胞可產(chǎn)生大量的包括IL-1β、IL-18等在內(nèi)的炎癥因子，導致肝損傷[11]。

有研究表明，P2X7受體直接與炎癥有關，在很多疾病過程中影響到IL-1β、IL-18的釋放[12]。P2X7受體是一種在體內(nèi)分布廣泛的ATP門控的陽離子通道蛋白，在腎、腦、肝、骨等組織中以及巨噬細胞、肥大細胞、淋巴細胞等細胞系中均有表達[13]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中P2X7的表達明顯增加；而P2X7受體抑制劑A438079組的結(jié)果表明，P2X7受體表達下調(diào)可以抑制 NLRP3炎性體活化，減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而減輕肝損傷。

IL-1β是一個有效的致炎因子，它被激活的前提是半胱天冬酶-1(caspase-1蛋白酶)的活化，caspase-1可以切割pro-IL-1β使其具備生物活性，并被細胞釋放出來；而有活性的caspase-1，正是由NLRP3炎癥體激活以后產(chǎn)生的。由此可見，P2X7、NLRP3、IL-1β三者之間有著極其重要的聯(lián)系[14]。 P2X7作為NLRP3的上游受體，經(jīng)ATP激活后，可引起NLRP3炎性體活化。NLRP3炎性體是NLRs炎性體家族成員之一，主要由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、caspase-1蛋白組成，在多種與炎性相關的肝病發(fā)生發(fā)展過程中都起到重要的調(diào)節(jié)作用。激活的NLRP3通過受體ASC募集caspase-1，進而引起促炎因子IL-1β、IL-18的合成和分泌，啟動并進一步放大炎癥反應[15]。

分析本實驗所得結(jié)果，與對照組相比，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)脂肪變性，模型組血清ALT、AST、TG、TCHO含量明顯升高， P2X7、NLRP3、ASC 表達明顯增強，同時發(fā)現(xiàn)伴隨三者表達的增高，IL-1β、IL-18的表達也明顯增強；與模型組相比，抑制劑A438079組小鼠肝組織脂肪變性減輕，血清中的ALT、AST、TG、TCHO含量都有不同程度的降低，P2X7、NLRP3、ASC表達明顯減弱，IL-1β、IL-18的表達也明顯減弱。由此我們推測，通過活化P2X7受體進而激活NLRP3炎性受體，可能是酒精性肝損傷中炎性因子表達水平上調(diào)的重要機制。

本課題研究結(jié)果表明，應用P2X7受體特異性抑制劑A438079可有效抑制酒精性肝損傷中的炎癥反應，該抑制劑可以成為臨床酒精肝損傷防治的新選擇。研究具有高選擇性、安全性及有效性的P2X7受體特異性抑制劑將為臨床肝臟疾病防治提供新的思路和新的方向。

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