馬淑梅，劉　莉

(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理評價研究中心，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海市生物物質(zhì)成藥性評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海　200437)

肌肉萎縮癥是一種慢性進行性疾病，其病因為編碼特定肌細(xì)胞蛋白的基因發(fā)生突變，目前已知至少21種單基因突變可導(dǎo)致肌肉萎縮[1]。杜氏肌肉萎縮(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是最為常見的類型，是一種X染色體隱性遺傳疾病，每年大約有1/3 500的男性新生兒罹患此病[2]。

患者會出現(xiàn)肌細(xì)胞壞死和肌無力致無法活動等癥狀，目前只能通過物理方法和甾體類激素進行姑息治療。在臨床前研究中，可用的肌肉萎縮動物模型有小鼠、犬等，秀麗隱桿線蟲以通體透明、生命周期短、基因與人類基因具有高度同源性等優(yōu)勢得到研發(fā)人員的關(guān)注。目前線蟲在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、衰老、真菌感染等領(lǐng)域藥物的研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用[3-4]。本文就秀麗隱桿線蟲在肌肉萎縮研究中的應(yīng)用進行總結(jié)。

1　肌肉萎縮秀麗隱桿線蟲模型

線蟲是一種個體小、生活周期短、容易繁殖后代、體細(xì)胞數(shù)目固定且特定細(xì)胞位置固定的簡單動物。1963年，Brenner[5]首次提出應(yīng)用線蟲進行神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究，1974年，他通過EMS誘變獲得300多個線蟲突變體，開始用線蟲進行分子和發(fā)育生物學(xué)的研究。2000年，Gieseler等[6]為了尋找通過錯誤表達(dá)可以抑制肌肉萎縮表型的基因，首次建立了肌肉萎縮線蟲模型。此后，許多研究人員利用線蟲進行肌肉萎縮研究。

1.1可用于肌肉萎縮研究的秀麗隱桿線蟲模型基因突變株線蟲基因組中含有人類抗肌萎縮蛋白類似基因dys-1，dys-1基因突變線蟲伴有運動能力下降、頭部過度彎曲等行為學(xué)改變，但不會出現(xiàn)肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞等肌肉萎縮癥狀[7]。研究表明，只缺失抗肌肉萎縮蛋白基因的mdx小鼠僅表現(xiàn)出輕微的肌肉萎縮癥狀，而同時缺失抗肌萎縮蛋白基因和生肌因子基因MyoD的小鼠會表現(xiàn)出類似人類肌肉萎縮的嚴(yán)重癥狀[8]，而線蟲中與小鼠生肌因子基因MyoD對應(yīng)的基因為hlh-1。Gieseler等[6]首次建立線蟲肌肉萎縮模型dys-1(cx18);hlh-1(cc561)突變株，該品系線蟲可呈現(xiàn)時間依賴的肌肉萎縮，表現(xiàn)出與人類肌肉萎縮比較接近的癥狀，可用于抗肌肉萎縮藥物的篩選。胞內(nèi)鈣離子水平的增加會通過激活炎癥反應(yīng)，促進肌肉萎縮的進程[9]。egl-19是線蟲肌肉細(xì)胞中主要的電壓門控鈣通道，Mariol等[10]構(gòu)建了dys-1；egl-19雙突變的線蟲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，egl-19基因功能獲得性突變的dys-1線蟲突變株隨著年齡的增加會出現(xiàn)過度收縮、頭部過度彎曲以及運動不協(xié)調(diào)等肌肉萎縮癥狀，dys-1(cx18);egl-19(ad695)線蟲突變株的體壁肌細(xì)胞會發(fā)生明顯變化，從而導(dǎo)致肌肉萎縮。unc-9基因編碼線蟲體壁細(xì)胞間隙連接蛋白，UNC-9蛋白表達(dá)于肌細(xì)胞臂和細(xì)胞間連接部位，是間隙連接的重要組成成分。線蟲體壁肌細(xì)胞通過間隙連接進行電緊張偶合，UNC-9蛋白缺失，使得肌細(xì)胞不能接受來自神經(jīng)細(xì)胞的信號，因此，unc-9基因突變的線蟲幾近癱瘓[11]。

1.2應(yīng)用秀麗隱桿線蟲突變株進行肌肉萎縮研究的相關(guān)實驗爬行是線蟲在瓊脂培養(yǎng)皿上的主要運動方式，因此許多研究者用爬行實驗來檢測線蟲神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的完整性，但線蟲模型在爬行實驗中僅表現(xiàn)出不明顯的肌肉萎縮疾病表型，因此，爬行實驗阻礙了線蟲模型在部分神經(jīng)肌肉紊亂研究中的應(yīng)用。由于線蟲在土壤基質(zhì)中大部分時間都在挖掘，研究人員[12]將線蟲溶液注入瓊脂預(yù)填充的10 mL塑料移液管距一端1 cm處，用保鮮蠟?zāi)し忾]，塑料移液管的另一端放置誘引劑丁二酮，用照相機拍攝線蟲挖掘過程，計數(shù)每組到達(dá)距離誘引劑4 cm處的線蟲數(shù)目，以判斷不同線蟲突變株的挖掘能力，進行挖掘?qū)嶒灒瑫r，以頭彎曲頻率、速率、回旋率、歐米伽彎曲等指標(biāo)來評價線蟲在肌肉萎縮研究中的運動情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，挖掘?qū)嶒炛芯€蟲可以很好地模擬人類肌肉萎縮表型。線蟲在液體培養(yǎng)基中的主要運動方式為游行[13]，游行與爬行具有不同的運動特征，或可應(yīng)用線蟲游泳實驗進行抗肌肉萎縮藥物篩選。此外，旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以用于模擬微重力對細(xì)胞功能的影響相關(guān)研究。因此，有研究者應(yīng)用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)模擬太空飛行微重力環(huán)境對線蟲體壁肌結(jié)構(gòu)和功能的影響，以探索太空飛行微重力所致肌肉萎縮的發(fā)病機制[14]。

1.3利用秀麗隱桿線蟲進行抗肌萎縮藥物篩選研究2004年，Gaud等[15]應(yīng)用dys-1(cx18);hlh-1(cc561)線蟲突變株篩選了約100個化合物對肌肉萎縮的治療作用，考察藥物作用后線蟲的運動學(xué)變化和肌細(xì)胞退化情況?；衔锶芤号c培養(yǎng)基混合至終濃度為1 g·L-1或者最大溶解度，使成年dys-1(cx18);hlh-1(cc561)線蟲突變株在含化合物的培養(yǎng)基上產(chǎn)卵過夜，之后將成蟲移除，蟲卵在15℃、食物充足情況下培養(yǎng)7 d，化合物通過表皮滲透和攝食進入線蟲體內(nèi)，這種給藥方法可以使線蟲持續(xù)暴露于化合物。固定并透化線蟲，與羅丹明-鬼筆環(huán)肽共孵育以對線蟲體壁肌細(xì)胞進行染色，顯微鏡下計數(shù)染色異常的肌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，強的松能降低40%抗肌萎縮蛋白缺陷的肌細(xì)胞的退化。該研究表明，線蟲可以作為篩選抗肌肉萎縮化合物的工具。

之后，又有研究人員Carre-Pierrat等[16-17]利用線蟲肌萎縮模型研究神經(jīng)激素5-羥色胺及其激動劑以及1 000多個已批準(zhǔn)上市的化合物進行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mmol·L-15-羥色胺處理的線蟲活動能力有所改善，體壁肌細(xì)胞的退化明顯降低，劑量效應(yīng)實驗發(fā)現(xiàn)，2.5 mmol·L-15-羥色胺仍具有延緩肌肉萎縮進展的作用。應(yīng)用5-羥色胺激動劑以及5-羥色胺重攝取蛋白抑制劑得到相似的結(jié)果。另外，醋甲唑胺0.5 g·L-1和雙氯非那胺0.1 g·L-1能明顯改善線蟲的運動能力并減少肌細(xì)胞的退化。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，醋甲唑胺或雙氯非那胺通過與線蟲醋酸酐酶CAH-4相互作用改善肌肉萎縮進展，該結(jié)果在mdx小鼠模型中得到驗證。這表明肌肉萎縮線蟲模型聯(lián)合mdx小鼠模型驗證策略可用于篩選有效的抗肌肉萎縮藥物。

Tab 1　Screening of anti-muscular atrophy drugs using C.elegans

本實驗室應(yīng)用dys-1(cx18);hlh-1(cc561)線蟲突變株對數(shù)個具有抗氧化活性的中藥提取物進行篩選，部分中藥提取物可明顯改善線蟲的運動能力，接下來將考察這些提取物對線蟲肌細(xì)胞數(shù)目及健康情況的影響，并進一步研究其作用機制。

1.4利用秀麗隱桿線蟲對肌肉萎縮發(fā)病機制相關(guān)信號通路的研究Oh等[18]發(fā)現(xiàn)，抗肌萎縮蛋白缺失并不直接導(dǎo)致肌細(xì)胞的死亡，而是使肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，dys-1線蟲突變株肌細(xì)胞的存活或者死亡決定于年齡依賴的細(xì)胞微環(huán)境。因此，提供一個持續(xù)更新的細(xì)胞微環(huán)境可能成為防止抗肌萎縮蛋白功能缺失的肌細(xì)胞死亡的一種途徑。研究表明[19]，IGF信號降低可通過daf-16提高應(yīng)激耐受，延遲固有蛋白聚集，延長壽命。Oh等先后構(gòu)建了肌細(xì)胞表達(dá)GFP的daf-2(e1370)；dys-1和daf-2(e1370)；daf-16(mu86)；dys-1線蟲突變株，得到IGF受體表達(dá)下調(diào)的線蟲株，評估該線蟲株肌細(xì)胞的健康情況并檢測其壽命。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，daf-2(e1370)；dys-1線蟲突變株肌細(xì)胞內(nèi)未見聚集的GFP信號，daf-2(e1370)；dys-1線蟲突變株壽命與daf-2(e1370)線蟲壽命相當(dāng)，而daf-2(e1370)；daf-16(mu86)；dys-1線蟲突變株肌細(xì)胞出現(xiàn)聚集的GFP信號，并且細(xì)胞核數(shù)量減少，這表明抑制IGF信號對線蟲肌細(xì)胞的保護作用依賴于daf-16。抑制IGF信號通路能夠減少daf-16依賴的dys-1基因突變線蟲肌肉細(xì)胞的死亡。這提示，抑制IGF信號通路的化合物可能具有治療肌肉萎縮的潛力。Lecroisey等[20]發(fā)現(xiàn)斑聯(lián)蛋白ZYX-1參與抗肌萎縮蛋白依賴的線蟲肌肉萎縮，通過構(gòu)建過表達(dá)ZYX-1的dys-1(cx-18)；hlh-1(cc561)線蟲突變株和ZYX-1功能缺失的dys-1(cx-18)；hlh-1(cc561)；zyx-1(gk190)線蟲突變株，應(yīng)用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色計數(shù)線蟲肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ZYX-1的線蟲和ZYX-1功能缺失的線蟲肌細(xì)胞損傷數(shù)目分別降低35%和60%，這表明ZYX-1促進dys-1(cx-18)；hlh-1(cc561)線蟲突變株肌細(xì)胞退化。Catoire等[21]研究發(fā)現(xiàn)，突變的多聚丙氨酸結(jié)合蛋白1(PABPN1)導(dǎo)致成年線蟲發(fā)生肌肉萎縮，去乙?；窼ir2、轉(zhuǎn)錄因子Foxo、AMPK共同調(diào)節(jié)PABPN1的毒性，因此，抑制Sir2或AMPK可能成為治療肌肉萎縮的新策略。

2　肌肉萎縮小鼠模型和犬模型

2.1mdx小鼠模型抗肌萎縮蛋白，編碼基因長度2.2 Mb，由79個主要外顯子和6個可變第一外顯子組成。mdx小鼠有5種不同的突變類型[22]，每一種突變模型都會造成骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)功能異常的抗肌萎縮蛋白。mdx小鼠的骨骼肌細(xì)胞大約在3周齡時開始出現(xiàn)退化，大約7周齡時出現(xiàn)大面積的肌肉壞死，同時伴有肌肉退化和再生。然而，與患者相比，mdx小鼠的肌萎縮癥狀較輕。mdx小鼠不出現(xiàn)明顯的壞死和關(guān)節(jié)攣縮，并且隨著時間推移僅部分骨骼肌纖維被脂肪細(xì)胞取代。DMD患者的肌腱連接嚴(yán)重受損，而mdx小鼠中僅出現(xiàn)輕微改變。另外，在mdx小鼠中，神經(jīng)肌肉突觸中突觸折疊的缺失對突觸傳遞沒有影響，而對于患者來說具有重大影響。由于mdx小鼠的壽命比正常小鼠僅縮短約20%，因此不能用mdx小鼠模型來進行不同治療策略延長壽命的試驗。

2.2mdx:utrn-/-小鼠模型導(dǎo)致mdx小鼠肌肉萎縮癥狀輕微的原因可能有：小鼠比人小并且弱，因此在傳遞肌力時對抗肌萎縮蛋白的依賴較人類??；與DMD患者相比，mdx小鼠中衛(wèi)星細(xì)胞較好的保持了其再生能力；在mdx小鼠中同源蛋白有效地補償了抗肌萎縮蛋白的缺失?；诖?，研究人員制備了抗肌萎縮蛋白和抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白雙缺失的嚴(yán)重肌萎縮模型[23]。

抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白(utrophin)，分子質(zhì)量376 ku，是抗肌萎縮蛋白同系物。抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白是由全長的異構(gòu)體組成，這兩個異構(gòu)體具有不同的啟動子，并且其N端起始外顯子不同?？辜∥s蛋白相關(guān)蛋白A表達(dá)于橫紋肌、脈絡(luò)膜叢、軟腦膜和腎小球。抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白B表達(dá)于血管。在胚胎發(fā)育期，抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白A貫穿于整個肌纖維膜，在產(chǎn)后發(fā)育階段，抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白A僅存在于神經(jīng)肌肉和肌腱連接處。在mdx小鼠模型中，抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白A的表達(dá)增加，并且在肌纖維膜上可見低水平的抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白A表達(dá)。抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白通過維持肌動蛋白骨架和肌纖維膜上DGC的相互作用，功能性地補償了mdx小鼠抗肌萎縮蛋白缺失?？辜∥s蛋白相關(guān)蛋白表達(dá)水平越高，則患者必須借助輪椅的時間越推后。目前，研究人員正在尋找可以提高肌纖維膜抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白表達(dá)的藥物來治療肌肉萎縮癥。

mdx:utrn-/-小鼠比野生型小鼠小，嚴(yán)重駝背，隨著年齡的增加行動力下降。運動系統(tǒng)會出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，大量的骨骼肌纖維被纖維組織取代從而導(dǎo)致攣縮。肌肉部位也變成脂肪組織。與野生型小鼠和mdx小鼠相比，其骨骼肌較小較弱，并且在肌肉收縮時易被損傷。其神經(jīng)肌肉連接不完整，突觸后折疊明顯減少。在肌腱連接處，終端肌小節(jié)很少與肌腱直接連接。mdx:utrn-/-小鼠會出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌病變。20周齡內(nèi)死亡。mdx:utrn-/-小鼠的病理程度和壽命與DMD患者較為相似，因此，成為檢測肌肉萎縮癥治療方法的一種較為適合的模型。

2.3肌肉萎縮犬模型犬類X連鎖肌肉萎縮癥模型有金獵犬(golden retriever, GRMD)、羅特韋爾犬和德國短毛犬模型。其中，GRMD犬在日本被培育成比格犬，稱為cxmdj。cxmdj與GRMD犬具有相同的點突變和相似的表型。最常用的模型為GRMD犬模型[24]。

犬類X連鎖肌肉萎縮癥模型與DMD病理過程相似。選擇性肌肉退化的早期，新生GRMD犬的死亡率很高。渡過新生兒期的犬會出現(xiàn)肌纖維再生和大面積炎癥反應(yīng)，一些肌肉部位出現(xiàn)高濃度的結(jié)晶鈣并且呈透明狀。大約2月齡時，肌纖維被纖維組織和脂肪細(xì)胞取代。6月齡出現(xiàn)明顯地關(guān)節(jié)攣縮，運動能力嚴(yán)重受損，肌肉萎縮、變?nèi)跚乙驯皇湛s損傷。GRMD犬會出現(xiàn)心肌病變和呼吸窘迫而死亡。與其他哺乳動物比較，cxmdj；犬具有與人類免疫系統(tǒng)類似的免疫系統(tǒng)，可對外源性物質(zhì)做出類似人類的免疫反應(yīng)[25]。但是由于人類肌萎縮的病理過程在犬類模型中沒有合適的功能性治療效應(yīng)評價指標(biāo)，且價格昂貴，易于死亡，因此應(yīng)用于抗肌萎縮藥物的篩選仍面臨較大挑戰(zhàn)。

3　小結(jié)

肌肉萎縮癥是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，目前尚無有效的治療方法，尋找一種經(jīng)濟、快速的藥物篩選方法對肌肉萎縮癥的治療至關(guān)重要。mdx小鼠和犬類X連鎖肌肉萎縮癥模型各具優(yōu)勢，但成本較高。秀麗隱桿線蟲作為整體動物模型，克服了細(xì)胞篩選對樣品的限制，同時，以突變體或者轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的線蟲疾病模型都具有明確的分子基礎(chǔ)，一旦化合物的活性被確定，相關(guān)的分子機制即可闡明。因此，秀麗隱桿線蟲在抗肌萎縮藥物毒性評價以及藥物篩選方面具有不可替代的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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