賴憲良，蘇嘉，陳鷗

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院　骨科，浙江　溫州　325000）

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為主要特征的一種全身代謝性骨病，嚴(yán)重影響人們的身體健康，破骨功能的增強(qiáng)是該病的主要原因之一[1]。RAW264.7細(xì)胞在受到核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factorκB ligand，RANKL）刺激后能夠分化形成多核破骨細(xì)胞，被視為破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，常被用來構(gòu)建骨質(zhì)疏松的細(xì)胞模型。

基質(zhì)衍生因子-1又稱為C-X-C模體趨化因子（CX-C motif chemokine 12，CXCL12），其能通過調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和黏附因子的分泌來影響細(xì)胞的增殖與遷移、腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[2]。研究表明CXCL12與多種腫瘤的骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]，而CXCL12對(duì)破骨細(xì)胞功能的影響研究較少。本研究使用CXCL12刺激RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞，旨在探討CXCL12對(duì)RANKL刺激下的破骨細(xì)胞分化及功能的影響，為骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究提供資料。

1　材料和方法

1.1材料鼠RAW264.7細(xì)胞（BG458，上海博谷生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Thermo Science公司）；胎牛血清（美國ScienCell公司）；雙抗（美國Gibco公司）；重組RANKL（美國R&D公司）；重組鼠CXCL12蛋白（美國Abcam公司）；AMD3100（美國Abcam公司）；兔單抗組織蛋白酶K（Cathepsin K）抗體（ab19027，美國Abcam公司）；羊單抗基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases，MMP-9）抗體（AF909，美國R&D公司）；兔單抗p-src（美國CST公司），TRAP染色試劑盒（美國Sigma公司），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Science公司）；CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測細(xì)胞增殖：將長勢(shì)良好的RAW264.7細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，更換含CXCL12的培養(yǎng)液，CXCL12的濃度為（0、25、50、100 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的1、2、3、4 d取出一板細(xì)胞進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，按實(shí)際使用說明進(jìn)行操作，并在450 nm波長處測各孔的吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔，通過比較同一天不同濃度CXCL12組細(xì)胞的吸光度值來觀察CXCL12對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.2.2TRAP染色檢測破骨細(xì)胞：RAW264.7細(xì)胞以4×103個(gè)/孔的密度接種于48孔板，24 h后使用含10 ng/mL RANKL的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、CXCL12組和AMD3100組；其中對(duì)照組僅使用RANKL培養(yǎng)，CXCL12組使用濃度為50 ng/mL的CXCL12刺激細(xì)胞（RANKL+CXCL12），AMD3100組使用濃度為650 nmol/L的AMD3100進(jìn)行培養(yǎng)（RANKL+AMD3100）。每48 h換液1次，第6天進(jìn)行TRAP染色實(shí)驗(yàn)，在倒置顯微鏡下觀察并拍片，細(xì)胞核大于3個(gè)的為陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3RT-PCR：將長勢(shì)良好的細(xì)胞接種于6孔板，將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、CXCL12組和AMD3100組，各組細(xì)胞的處理方式同上，在誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d后收獲細(xì)胞，使用Trizol試劑按照試劑盒上的說明提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行RT-PCR，所用引物由上海生工生物工程公司進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，序列見表1。PCR反應(yīng)在RT-PCR儀上進(jìn)行。PCR的產(chǎn)物按計(jì)算公式2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

表1　RT-PCR引物的基因序列

1.2.4Western blot：將細(xì)胞接種于6孔板，各組細(xì)胞的處理方式同上，在培養(yǎng)4 d后收獲細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒上的說明提取總蛋白，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量實(shí)驗(yàn)，將各組的蛋白濃度調(diào)成一致，取40 μg蛋白進(jìn)行變性，蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育抗體，暗室曝光拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CXCL12對(duì)細(xì)胞增殖的影響CCK8檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的4 d中，0、25、50、100 ng/mL CXCL12組細(xì)胞的增殖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.2CXCL12對(duì)RANKL誘導(dǎo)的細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的影響各組在誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后，TRAP染色后均可見典型的陽性細(xì)胞，呈橢圓形、多角形或不規(guī)則形，體積是單核細(xì)胞的數(shù)十倍，周圍有偽足伸出。TRAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果示：對(duì)照組為92.56±9.67，CXCL12組為148.00±11.78，AMD3100組為72.00±12.21。與對(duì)照組比，CXCL12組TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05），AMD3100組的TRAP染色陽性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）。

表2　CXCL12對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響（n=9，　±s）

2.3CXCL12對(duì)MMP-9、c-src、CathepsinKmRNA表達(dá)的影響在使用CXCL12刺激細(xì)胞后，c-src、MMP-9、Cathepsin K的mRNA表達(dá)均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；使用AMD3100后，c-src、MMP-9、Cathepsin K的mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖1　CXCL12對(duì)RANKL誘導(dǎo)的細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的影響（TRAP染色）

圖2　CXCL12對(duì)MMP-9、Cathepsin K和c-src mRNA表達(dá)的影響

2.4CXCL12對(duì)MMP-9、p-src、CathepsinK蛋白表達(dá)的影響在使用CXCL12刺激細(xì)胞后，p-src、MMP-9、Cathepsin K的蛋白表達(dá)均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；使用AMD3100后，p-src、MMP-9、Cathepsin K的蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

3　討論

在健康的機(jī)體中，成骨與破骨功能處于一種動(dòng)態(tài)的平衡之中，各種原因?qū)е碌墓切纬烧系K或骨吸收增強(qiáng)是骨質(zhì)疏松的主要發(fā)病原因。CXCL12是CXC趨化因子家族中的一員，它能與其受體CXCR4結(jié)合，啟動(dòng)下游的信號(hào)通路從而調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的存活、遷移、歸巢，CXCL12在胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞的遷移中也發(fā)揮重要作用[4]。崔立群等[5]認(rèn)為CXCL12與乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，F(xiàn)REIREDE-LIMA等[6]研究發(fā)現(xiàn)CXCL12是多發(fā)性骨髓瘤關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)因子，SUCUR等[7]認(rèn)為CXCL12參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，與破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的歸巢有關(guān)。這些研究結(jié)果提示CXCL12與骨代謝疾病的發(fā)病相關(guān)，而CXCL12對(duì)破骨細(xì)胞的功能有何影響尚不明確，因此在本研究中，我們使用CXCL12刺激RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞，觀察CXCL12對(duì)破骨細(xì)胞分化及功能的影響。

圖3　CXCL12對(duì)p-src、MMP-9和Cathepsin K蛋白表達(dá)的影響

增殖能力是細(xì)胞的主要特征之一，是機(jī)體發(fā)育與組織修復(fù)再生的基礎(chǔ)。本研究使用不同濃度的CXCL12刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力無明顯改變。WANG等[8]發(fā)現(xiàn)CXCL12參與了神經(jīng)母細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控過程，能夠促進(jìn)小鼠神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖，與本研究的結(jié)果完全相反，這可能是由于實(shí)驗(yàn)中選用的細(xì)胞不同，CXCL12發(fā)揮的作用不同所導(dǎo)致的。

AMD3100是CXCL12受體CXCR4的非肽類阻斷劑，能夠特異性與CXCR4結(jié)合，從而阻斷CXCL12/CXCR4信號(hào)通路[9]。本研究使用AMD3100作為CXCL12的阻斷劑，TRAP染色結(jié)果顯示，使用RANKL刺激細(xì)胞6 d后，AMD3100組的多核破骨細(xì)胞生成數(shù)目要明顯少于對(duì)照組和CXCL12組，提示使用AMD3100抑制CXCL12能抑制RANKL刺激引起的細(xì)胞破骨分化。

磷酸化的src（p-src）與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組、力學(xué)穩(wěn)態(tài)及皺褶緣的形成有關(guān)[10-11]。而c-src缺乏將導(dǎo)致細(xì)胞骨架的運(yùn)動(dòng)和變化減少，骨吸收活性降低[12]。MMP-9能夠破壞骨基質(zhì)，使骨膠原暴露、破壞骨膠原纖維形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[13]。Cathepsin K能夠降解骨組織中的I型膠原，并能加速骨組織中的骨鈣素、骨橋蛋白等非膠原蛋白的降解[14-15]。本研究中我們選用這3種因子來觀察細(xì)胞骨吸收能力的改變情況。研究結(jié)果顯示在使用含RANKL的培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d后，這3種破骨細(xì)胞功能相關(guān)分子的表達(dá)在CXCL12組均升高而AMD3100組表達(dá)降低，說明CXCL12能夠提高破骨細(xì)胞的骨吸收能力，使用AMD3100抑制細(xì)胞中的CXCL12將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的骨吸收能力降低。表明CXCL12在破骨細(xì)胞的骨吸收功能中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，骨吸收增強(qiáng)是骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要原因之一，本研究發(fā)現(xiàn)CXCL12能夠促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分化形成破骨細(xì)胞，并能增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收能力；使用CXCL12受體阻斷劑AMD3100能抑制細(xì)胞分化并降低細(xì)胞的破骨功能。

參考文獻(xiàn)：

[1] 徐陸晨, 李運(yùn)峰. 骨質(zhì)疏松性骨折藥物治療的研究進(jìn)展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志, 2017, 23(7): 947-953.

[2] SLEIGHTHOLM R L, NEILSEN B K, LI J, et al. Emerging roles of the CXCL12/CXCR4 axis in pancreatic cancer progression and therapy[J]. Pharmacol Ther, 2017, 179: 158-170.

[3] GRAVINA G L, MANCINI A, MUZI P, et al. CXCR4 pharmacogical inhibition reduces bone and soft tissue metastatic burden by affecting tumor growth and tumorigenic potential in prostate cancer preclinical models[J]. Prostate, 2015,75(12): 1227-1246.

[4] WEIDLE U H, BIRZELE F, KOLLMORGEN G, et al. Molecular mechanisms of bone metastasis[J]. Cancer Genomics Proteomics, 2016, 13(1): 1-12.

[5] 崔立群, 王曉蕊, 姜忠敏,等. C X C L 12誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞C X C R 4表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移[J]. 腫瘤, 2013, 33(6):497-501.

[6] FREIRE-DE-LIMA L, NARDY A, RAMOS-JUNIOR E S,et al. Multiple myeloma cells express key immunoregulatory cytokines and modulate the monocyte migratory response[J].Front Med (Lausanne), 2017, 4: 92.

[7] SUCUR A, JAJIC Z, ARTUKOVIC M, et al. Chemokine signals are crucial for enhanced homing and differentiation of circulating osteoclast progenitor cells[J]. Arthritis Res Ther, 2017, 19(1): 142-158.

[8] WANG Y, XU P, QIU L, et al. CXCR7 participates in CXCL12-mediated cell cycle and proliferation regulation in mouse neural progenitor cells[J]. Curr Mol Med, 2016, 16(8): 738-746.

[9] SEEMANN S, LUPP A. Administration of AMD3100 in endotoxemia is associated with pro-inflammatory, pro-oxidative, and pro-apoptotic effects in vivo[J]. J Biomed Sci,2016, 23(1): 68-86.

[10] IZAWA T, ZOU W, CHAPPEL J C, et al. C-Src links a RANK/alphavbeta3 integrin complex to the osteoclast cytoskeleton[J]. Mol Cell Biol, 2012, 32(14): 2943-2953.

[11] HAN S, LIU Q, WANG F, et al. Targeting the SH3 domain of human osteoclast-stimulating factor with rationally designed peptoid inhibitors[J]. J Pept Sci, 2016, 22(8): 533-539.

[12] 朱再勝, 戴爽, 鄭靖宇, 等. 番茄紅素對(duì)慢性低氧小鼠骨密度和R A N K L/O P G的影響[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015,45(3): 185-189.

[13] JUNRUI P, BINGYUN L, YANHUI G, et al. Relationship between fluoride exposure and osteoclast markers during RANKL-induced osteoclast differentiation[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2016, 46: 241-245.

[14] LIPS K S, KNEFFEL M, WILLSCHEID F, et al. Altered ultrastructure, density and cathepsin K expression in bone of female muscarinic acetylcholine receptor M3 knockout mice[J]. Int Immunopharmacol, 2015, 29(1): 201-207.

[15] 阮立奇, 黃波. Wn t/β-c a t e n i n信號(hào)通路在去睪丸小鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 47(7):519-522.