賴憲良，蘇嘉，陳鷗

（溫州市中西醫(yī)結合醫(yī)院　骨科，浙江　溫州　325000）

骨質疏松癥是以骨量減少、骨微觀結構退化為主要特征的一種全身代謝性骨病，嚴重影響人們的身體健康，破骨功能的增強是該病的主要原因之一[1]。RAW264.7細胞在受到核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factorκB ligand，RANKL）刺激后能夠分化形成多核破骨細胞，被視為破骨細胞的前體細胞，常被用來構建骨質疏松的細胞模型。

基質衍生因子-1又稱為C-X-C模體趨化因子（CX-C motif chemokine 12，CXCL12），其能通過調控肌動蛋白細胞骨架重組和黏附因子的分泌來影響細胞的增殖與遷移、腫瘤的生長與轉移[2]。研究表明CXCL12與多種腫瘤的骨轉移密切相關[3]，而CXCL12對破骨細胞功能的影響研究較少。本研究使用CXCL12刺激RANKL誘導的RAW264.7細胞，旨在探討CXCL12對RANKL刺激下的破骨細胞分化及功能的影響，為骨質疏松的實驗研究提供資料。

1　材料和方法

1.1材料鼠RAW264.7細胞（BG458，上海博谷生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Thermo Science公司）；胎牛血清（美國ScienCell公司）；雙抗（美國Gibco公司）；重組RANKL（美國R&D公司）；重組鼠CXCL12蛋白（美國Abcam公司）；AMD3100（美國Abcam公司）；兔單抗組織蛋白酶K（Cathepsin K）抗體（ab19027，美國Abcam公司）；羊單抗基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases，MMP-9）抗體（AF909，美國R&D公司）；兔單抗p-src（美國CST公司），TRAP染色試劑盒（美國Sigma公司），cDNA反轉錄試劑盒（美國Thermo Science公司）；CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；酶標儀（美國BioTek公司）。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測細胞增殖：將長勢良好的RAW264.7細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，更換含CXCL12的培養(yǎng)液，CXCL12的濃度為（0、25、50、100 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的1、2、3、4 d取出一板細胞進行CCK-8實驗，按實際使用說明進行操作，并在450 nm波長處測各孔的吸光度，實驗重復3次，每次3個復孔，通過比較同一天不同濃度CXCL12組細胞的吸光度值來觀察CXCL12對細胞增殖的影響。

1.2.2TRAP染色檢測破骨細胞：RAW264.7細胞以4×103個/孔的密度接種于48孔板，24 h后使用含10 ng/mL RANKL的培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，將細胞分為3組：對照組、CXCL12組和AMD3100組；其中對照組僅使用RANKL培養(yǎng)，CXCL12組使用濃度為50 ng/mL的CXCL12刺激細胞（RANKL+CXCL12），AMD3100組使用濃度為650 nmol/L的AMD3100進行培養(yǎng)（RANKL+AMD3100）。每48 h換液1次，第6天進行TRAP染色實驗，在倒置顯微鏡下觀察并拍片，細胞核大于3個的為陽性細胞進行計數(shù)。

1.2.3RT-PCR：將長勢良好的細胞接種于6孔板，將實驗分為對照組、CXCL12組和AMD3100組，各組細胞的處理方式同上，在誘導培養(yǎng)4 d后收獲細胞，使用Trizol試劑按照試劑盒上的說明提取總RNA，反轉錄合成cDNA并進行RT-PCR，所用引物由上海生工生物工程公司進行設計合成，序列見表1。PCR反應在RT-PCR儀上進行。PCR的產(chǎn)物按計算公式2-ΔΔCt的方法進行分析。

表1　RT-PCR引物的基因序列

1.2.4Western blot：將細胞接種于6孔板，各組細胞的處理方式同上，在培養(yǎng)4 d后收獲細胞，按照蛋白提取試劑盒上的說明提取總蛋白，使用BCA法進行蛋白定量實驗，將各組的蛋白濃度調成一致，取40 μg蛋白進行變性，蛋白電泳，轉膜，封閉，孵育抗體，暗室曝光拍照。

1.3統(tǒng)計學處理方法采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1CXCL12對細胞增殖的影響CCK8檢測結果顯示，培養(yǎng)的4 d中，0、25、50、100 ng/mL CXCL12組細胞的增殖差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.2CXCL12對RANKL誘導的細胞形成破骨細胞的影響各組在誘導培養(yǎng)6 d后，TRAP染色后均可見典型的陽性細胞，呈橢圓形、多角形或不規(guī)則形，體積是單核細胞的數(shù)十倍，周圍有偽足伸出。TRAP陽性細胞計數(shù)結果示：對照組為92.56±9.67，CXCL12組為148.00±11.78，AMD3100組為72.00±12.21。與對照組比，CXCL12組TRAP染色陽性細胞數(shù)增多（P＜0.05），AMD3100組的TRAP染色陽性細胞數(shù)減少（P＜0.05）。

表2　CXCL12對RAW264.7細胞增殖的影響（n=9，　±s）

2.3CXCL12對MMP-9、c-src、CathepsinKmRNA表達的影響在使用CXCL12刺激細胞后，c-src、MMP-9、Cathepsin K的mRNA表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；使用AMD3100后，c-src、MMP-9、Cathepsin K的mRNA表達均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖1　CXCL12對RANKL誘導的細胞形成破骨細胞的影響（TRAP染色）

圖2　CXCL12對MMP-9、Cathepsin K和c-src mRNA表達的影響

2.4CXCL12對MMP-9、p-src、CathepsinK蛋白表達的影響在使用CXCL12刺激細胞后，p-src、MMP-9、Cathepsin K的蛋白表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；使用AMD3100后，p-src、MMP-9、Cathepsin K的蛋白表達均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

3　討論

在健康的機體中，成骨與破骨功能處于一種動態(tài)的平衡之中，各種原因導致的骨形成障礙或骨吸收增強是骨質疏松的主要發(fā)病原因。CXCL12是CXC趨化因子家族中的一員，它能與其受體CXCR4結合，啟動下游的信號通路從而調控間充質干細胞的存活、遷移、歸巢，CXCL12在胚胎發(fā)育、炎癥反應、腫瘤細胞的遷移中也發(fā)揮重要作用[4]。崔立群等[5]認為CXCL12與乳腺癌的骨轉移密切相關，F(xiàn)REIREDE-LIMA等[6]研究發(fā)現(xiàn)CXCL12是多發(fā)性骨髓瘤關鍵的免疫調節(jié)因子，SUCUR等[7]認為CXCL12參與了類風濕性關節(jié)炎的發(fā)病過程，與破骨細胞祖細胞的歸巢有關。這些研究結果提示CXCL12與骨代謝疾病的發(fā)病相關，而CXCL12對破骨細胞的功能有何影響尚不明確，因此在本研究中，我們使用CXCL12刺激RANKL誘導的RAW264.7細胞，觀察CXCL12對破骨細胞分化及功能的影響。

圖3　CXCL12對p-src、MMP-9和Cathepsin K蛋白表達的影響

增殖能力是細胞的主要特征之一，是機體發(fā)育與組織修復再生的基礎。本研究使用不同濃度的CXCL12刺激細胞，發(fā)現(xiàn)細胞的增殖能力無明顯改變。WANG等[8]發(fā)現(xiàn)CXCL12參與了神經(jīng)母細胞的細胞周期調控過程，能夠促進小鼠神經(jīng)祖細胞的增殖，與本研究的結果完全相反，這可能是由于實驗中選用的細胞不同，CXCL12發(fā)揮的作用不同所導致的。

AMD3100是CXCL12受體CXCR4的非肽類阻斷劑，能夠特異性與CXCR4結合，從而阻斷CXCL12/CXCR4信號通路[9]。本研究使用AMD3100作為CXCL12的阻斷劑，TRAP染色結果顯示，使用RANKL刺激細胞6 d后，AMD3100組的多核破骨細胞生成數(shù)目要明顯少于對照組和CXCL12組，提示使用AMD3100抑制CXCL12能抑制RANKL刺激引起的細胞破骨分化。

磷酸化的src（p-src）與肌動蛋白細胞骨架的重組、力學穩(wěn)態(tài)及皺褶緣的形成有關[10-11]。而c-src缺乏將導致細胞骨架的運動和變化減少，骨吸收活性降低[12]。MMP-9能夠破壞骨基質，使骨膠原暴露、破壞骨膠原纖維形成的網(wǎng)狀結構[13]。Cathepsin K能夠降解骨組織中的I型膠原，并能加速骨組織中的骨鈣素、骨橋蛋白等非膠原蛋白的降解[14-15]。本研究中我們選用這3種因子來觀察細胞骨吸收能力的改變情況。研究結果顯示在使用含RANKL的培養(yǎng)液培養(yǎng)4 d后，這3種破骨細胞功能相關分子的表達在CXCL12組均升高而AMD3100組表達降低，說明CXCL12能夠提高破骨細胞的骨吸收能力，使用AMD3100抑制細胞中的CXCL12將會導致細胞的骨吸收能力降低。表明CXCL12在破骨細胞的骨吸收功能中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，骨吸收增強是骨質疏松發(fā)生的主要原因之一，本研究發(fā)現(xiàn)CXCL12能夠促進RANKL誘導的RAW264.7細胞分化形成破骨細胞，并能增強破骨細胞的骨吸收能力；使用CXCL12受體阻斷劑AMD3100能抑制細胞分化并降低細胞的破骨功能。

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