吳秀紹，吳競，劉子夏，陳旭嬌

（浙江醫(yī)院，浙江　杭州　310000，1.老年科；2.腫瘤科）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一種常見的心血管疾病，主要的病理改變是心室重構(gòu)[1]。而影響心室重構(gòu)的因素包括交感神經(jīng)的激活、RAAS系統(tǒng)的激活、炎癥反應(yīng)、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）系統(tǒng)平衡失調(diào)和氧化應(yīng)激損傷等[2]。因此，改善MMPs平衡失調(diào)，延緩心室重構(gòu)是治療心力衰竭，延緩心力衰竭進(jìn)展的途徑之一。阿魏酸是一種從當(dāng)歸、川穹等中草藥材中提取的芳香酸，具有抗血小板聚集、鎮(zhèn)痛、緩解血管痙攣?zhàn)饔肹3]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸能通過影響MMPs和基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制物（matrix metalloproteinase specific inhibitors，TIMPs）的表達(dá)，有效緩解酒精誘導(dǎo)的肝臟纖維化[4]。ALAM等[5]研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸能有效改善高血壓大鼠心臟的結(jié)構(gòu)和功能，而心室重構(gòu)在高血壓中也具有重要作用。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子-3（signal transduction and activators of transcription 3，STAT3）被報(bào)道在心力衰竭的進(jìn)展中具有重要作用，其激活后通過調(diào)控MMPs和TIMPs從而加重心室重構(gòu)[6]。本研究旨在探討阿魏酸對CHF的影響以及在阿魏酸的作用下是否通過抑制磷酸化STAT3（p-STAT3）從而影響MMP-1和TIMP-1的變化，為臨床上治療CHF提供新的思路。

1　材料和方法

1.1動物模型制備和分組雄性SD大鼠50只，SPF級，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（浙）2017-0007。阿魏酸由上海中藥制藥技術(shù)有限公司提供。用冠脈結(jié)扎法制作大鼠CHF模型[7]（假手術(shù)組不結(jié)扎冠狀動脈），經(jīng)多普勒超聲心動圖檢測左室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）值≤60%視為CHF造模成功。將大鼠分為假手術(shù)組、模型組（采用主動脈縮窄術(shù)制作CHF大鼠模型）、25 mg/kg阿魏酸組（CHF+注射25 mg/kg阿魏酸）、50 mg/kg阿魏酸組（CHF+注射50 mg/kg阿魏酸）和100 mg/kg阿魏酸組（CHF+注射100 mg/kg阿魏酸），共5組，每組10只。術(shù)后8周檢測心功能。

1.2主要藥品及試劑Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；p-STAT3、GAPDH抗體購自美國Sigma公司；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；引物購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)相關(guān)試劑購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司。

1.3心功能檢測10%水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔麻醉，剪毛，仰臥固定，M型超聲心動圖連續(xù)檢測3個不同心動周期左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）及左室舒張末期內(nèi)徑（left Diastolic end-systolic diameter，LVEDD）取其平均值，并計(jì)算左心室EF值。

1.4Masson染色觀察心肌膠原纖維將心室肌組織固定并石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度約4 μm。切片脫蠟至水，用蘇木素染色液染色，乙醇分化液進(jìn)行分化水洗，用Masson藍(lán)化液返藍(lán)，蒸餾水水洗后麗春紅染色，弱酸工作液進(jìn)行洗滌，磷鉬酸浸洗，繼續(xù)用苯胺藍(lán)染色，用弱酸洗滌，然后常規(guī)脫水封片。視野下藍(lán)色為心肌膠原纖維，觀察心肌膠原纖維在心肌組織中的表達(dá)情況。

1.5Westernblot檢測大鼠心肌組織中p-STAT3、MMP-1和TIMP-1的蛋白表達(dá)水平提取心室肌組織剪碎后放入液氮進(jìn)行研磨，加入500 μL蛋白裂解液繼續(xù)研磨，離心去上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。加樣，經(jīng)電泳蛋白分離和轉(zhuǎn)膜，予5%脫脂奶粉封閉30 min。一抗孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再用二抗常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光，經(jīng)Quantity One進(jìn)行灰度測量分析。

1.6PCR檢測大鼠心肌組織中MMP-1和TIMP-1的mRNA表達(dá)水平將0.1 g心肌組織剪碎后加1 mL TRIzol提取組織總RNA，分光光度計(jì)測定RNA濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MMP-1上游引物：5’-CGGCAGAATGTG GAA-3’，下游引物：5’-AACGAGGATTGTTGTGAGTA-3’；TIMP-1上游引物：5’-TCTGGCATCCTCTTGTTG-3’，下游引物：5’-CGCTGGTATAAGGTGGTC-3’。以U6作為測定內(nèi)參，上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。同時以U6為內(nèi)參照，采用2-△△CT法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各劑量組阿魏酸對CHF大鼠心功能的影響與假手術(shù)組比，模型組LVESD、LVEDD顯著增大，EF顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比，不同濃度阿魏酸干預(yù)下的LVESD、LVEDD明顯縮小，EF明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　阿魏酸對CHF大鼠心功能影響（n=10，±s）

表1　阿魏酸對CHF大鼠心功能影響（n=10，±s）

與假手術(shù)組比：aP＜0.05；與模型組比：bP＜0.05

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2.2各劑量組阿魏酸對CHF大鼠膠原組織的影響與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的心肌細(xì)胞明顯壞死，膠原沉積并呈彌漫性、浸潤性分布，見圖1ab；與模型組相比，各劑量阿魏酸組膠原纖維呈現(xiàn)樹突樣分散在心肌組織中，膠原含量明顯減少，見圖1c-e。

圖1　各劑量組阿魏酸對CHF大鼠膠原組織的影響（Masson染色，×400）

2.3各劑量組阿魏酸對CHF大鼠心肌組織p-STAT3表達(dá)的影響與假手術(shù)組相比，模型組的p-STAT3表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，不同濃度的阿魏酸干預(yù)下，CHF大鼠心肌組織中的STAT3表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.4各劑量組阿魏酸對CHF大鼠心肌組織MMP-1和TIMP-1mRNA表達(dá)的影響與假手術(shù)組比，模型組MMP-1 mRNA表達(dá)明顯升高，TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比，不同濃度的阿魏酸干預(yù)下，CHF大鼠心肌組織中MMP-1 mRNA表達(dá)下降，TIMP-1 mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比，模型組MMP-1/TIMP-1值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，不同濃度的阿魏酸干預(yù)下MMP-1/TIMP-1值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

2.5各劑量組阿魏酸對CHF大鼠心肌組織MMP-1和TIMP-1蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組的MMP-1表達(dá)明顯升高，TIMP-1表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，不同濃度的阿魏酸干預(yù)下，CHF大鼠心肌組織中的MMP-1表達(dá)下降，TIMP-1表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比，模型組MMP-1/TIMP-1值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，不同濃度的阿魏酸干預(yù)下MMP-1/TIMP-1值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖2　各劑量組阿魏酸對CHF大鼠心肌組織p-STAT3表達(dá)的影響

圖3　阿魏酸對CHF大鼠心肌組織MMP-1和TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響

3　討論

我國中草藥資源豐富，種類繁多。從中草藥的有效成分中探尋并開發(fā)療效肯定的抗心力衰竭藥物意義重大。阿魏酸是一種常見的酚酸類物質(zhì)，PERFILOVA等[8]報(bào)道阿魏酸對心血管有明顯的保護(hù)作用，與其抑制心肌脂質(zhì)過氧化和提高心肌抗氧化的活性有關(guān)。YOGEETA等[9]發(fā)現(xiàn)阿魏酸能誘導(dǎo)抗氧化酶活性，在實(shí)驗(yàn)性的心力衰竭模型中具有治療作用。本研究通過Masson染色發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的心肌膠原纖維沉積明顯增多，而不同濃度的阿魏酸干預(yù)后，心肌膠原纖維逐漸減少，提示阿魏酸能改善心肌膠原纖維沉積，改善心室重構(gòu)。

圖4　各劑量組阿魏酸對CHF大鼠心肌組織MMP-1和TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

STAT3蛋白是JAK-STATs信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白，壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥大、心力衰竭與這一通路密切相關(guān)[10]。KUNISADA等[11]報(bào)道過度表達(dá)STAT3蛋白能導(dǎo)致大鼠心肌組織心肌細(xì)胞肥大。ZHANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)抑制STAT3蛋白活化能顯著降低心肌細(xì)胞肥大，抑制心肌細(xì)胞凋亡，阻止心肌纖維化，改善心室重構(gòu)，從而有效地延緩心力衰竭。本研究Western blot結(jié)果表明在CHF大鼠的心肌組織中，STAT3的蛋白活化表達(dá)升高，阿魏酸干預(yù)之后，能顯著降低活化的STAT3蛋白表達(dá)，從而改善心室重構(gòu)，與上述研究結(jié)果相一致。

在CHF進(jìn)展中，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解平衡失調(diào)導(dǎo)致心肌組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)功能異常[13]。MMPs/TIMPs的動態(tài)平衡是維持心臟結(jié)構(gòu)和心肌膠原纖維的重要因素[2]。MMPs在心室重構(gòu)中能直接降解心肌細(xì)胞外基質(zhì)，引起心肌細(xì)胞間質(zhì)退化，導(dǎo)致心肌排列紊亂，收縮功能異常，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)，加重CHF[14]。本研究發(fā)現(xiàn)CHF大鼠模型組MMP-1的表達(dá)明顯升高，TIMP-1的表達(dá)明顯降低，表明CHF大鼠心肌組織中存在MMP-1和TIMP-1動態(tài)失衡的情況，由于TIMP-1表達(dá)減少，MMP-1表達(dá)升高，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白大量降解，繼而導(dǎo)致心室重構(gòu)，而阿魏酸能減少STAT3活化，抑制CHF大鼠心肌組織中MMP-1蛋白和基因表達(dá)，上調(diào)TIMP-1蛋白和基因表達(dá)，降低MMP-1/TIMP-1的比值，阻止MMP-1對心肌膠原的降解，能協(xié)調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和合成，延緩心室重構(gòu)，改善心肌順應(yīng)性，增加心肌收縮力，起到治療CHF的作用。

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