張健波，朱娜萍，陳潔，劉開平，葉涵，許文，潘建春

（溫州醫(yī)科大學　藥學院，浙江 溫州 325035）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以腸道不適或反復腹痛為主要特征，并且伴有排便習慣改變和糞便性狀異常的功能性胃腸疾病[1]。近期研究表明[2]，IBS除了與胃食管反流、功能性消化不良等胃腸道疾病共病外，其與應(yīng)激相關(guān)的情緒障礙疾病（如抑郁、焦慮）共病率高達30%～50%[3-4]，提示IBS與精神疾病可能存在共同的生理和病理過程。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種從虎杖中提取的多酚類化合物。研究表明，RES具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑郁活性，猜測其對IBS的焦慮、抑郁樣和腸道超敏狀態(tài)有一定的治療作用[5-7]。為此，本研究探索了RES對慢急性聯(lián)合應(yīng)激（chronic acute combined stress，CACS）誘導的IBS大鼠可能存在的精神狀態(tài)異常和消化道功能紊亂的改善作用及其作用機制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1主要藥物和試劑： RES、氟西汀（fluoxetine，F(xiàn)LU）和地西泮（diazepam，DIA）均購于美國Sigma公司。羧甲基纖維素鈉（sodium salt of caboxy methyl cellulose，CMC-Na）購于上海博蘊生物科技有限公司。一抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體購于英國Abcam生物公司，一抗β-actin、GAPDH抗體購于美國Bioworld生物科技公司，二抗Goat anti-Rabbit IgG（H+L）HRP購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。EZ-ECL曝光液購于以色列Biological Industries公司。

1.1.2主要儀器：SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SCIENTZ-48高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Eppendorf 5417R小型臺式冷凍型離心機（德國Eppendorf公司）；Bio-Rad小垂直板電泳槽和Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；SpectraMax 190全波長酶標儀（美國Molecular Devices Corporation公司）。

1.1.3動物分組和處理：42只雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～180 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002。大鼠在室溫（23±1）℃，濕度50%±5%，自然光照，晝夜節(jié)律，自由攝食飲水條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后隨機分為7組，每組6只，分別為正常對照組、CACS模型組、不同劑量白藜蘆醇組（10、20、40 mg/kg，i.g.）、氟西汀組（10 mg/kg，i.g.）以及地西泮組（1 mg/kg，i.p.）。RES溶于0.5% CMC-Na中，并且于給藥當天稀釋至所需濃度，氟西汀和地西泮用0.9%氯化鈉溶液溶解。按照分組以灌胃或者腹腔注射的方式連續(xù)給藥22 d，其中正常對照組和CACS模型組大鼠按體質(zhì)量（0.5 mL/100 g）灌胃給予0.5% CMCNa。氟西汀與地西泮均為陽性對照藥，其中氟西汀用于藥物抗抑郁樣作用對照，地西泮用于藥物抗焦慮樣作用對照。

1.2方法

1.2.1大鼠CACS模型建立：除正常對照組大鼠外，其余實驗大鼠在應(yīng)激期間孤籠飼養(yǎng)并采用CACS的方式建立模型[8-9]，即在連續(xù)給予21 d慢性不可預(yù)知應(yīng)激后，于第22 d給予實驗大鼠3 h急性束縛應(yīng)激。其中慢性不可預(yù)知應(yīng)激包括：禁食24 h，禁水24 h，4 ℃冰水游泳5 min，45°傾斜籠子6 h，潮濕墊料6 h，光照過夜，夾尾3 min等。行為學測試于應(yīng)激結(jié)束后24 h進行。

1.2.2強迫游泳實驗（forced swimming test，F(xiàn)ST）：是最常用于抗抑郁藥物療效評估的動物模型之一[10]。在PORSOLT等[11]所描述的方法上稍加修改后進行FST試驗。試驗分為兩個部分，分別為預(yù)測試階段和測試階段。預(yù)測試階段：迫使大鼠在盛有30 cm深度清水[水溫（25±1）℃]的透明圓柱形玻璃容器（直徑25 cm，高度45 cm）中游泳15 min。測試階段：在預(yù)測試結(jié)束24 h后進入測試階段，大鼠在相同環(huán)境下進行5 min FST測試，并用攝像機記錄該過程。由2位對實驗不知情者統(tǒng)計5 min內(nèi)大鼠的累計不動時間。當大鼠停止掙扎，浮在水中保持不動或僅做一些必要的輕微動作保持頭部浮在水面上時即可視為不動狀態(tài)。

1.2.3大理石掩埋實驗（marble-burying task，MBT）：采用MBT來評估藥物的抗焦慮樣作用。參照文獻[12]所描述的方法稍許改動：在鋪有5 cm厚度玉米芯墊料的盒子（45 cm×30 cm×40 cm）上以“3+3+3”的形式擺放9顆直徑為2.3 cm的玻璃彈珠。將大鼠單獨依次放入盒中，記錄大鼠10 min內(nèi)掩埋玻璃彈珠顆數(shù)，其中彈珠至少50%體積被墊料覆蓋后才能視為被掩埋。

1.2.4腸道動力學測試：按照文獻[13]所述方法，評估實驗大鼠腸道動力。用束縛器固定大鼠，在確保大鼠不受其他傷害的條件下，限制大鼠的正?；顒印Ｓ涗? h內(nèi)大鼠的排便顆數(shù)。

1.2.5內(nèi)臟敏感性實驗：采用腹壁撤退反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）評分評價大鼠內(nèi)臟敏感程度。具體實驗過程如下[14]：實驗前大鼠禁食24 h、不禁水，使其排出殘余糞便。實驗過程中大鼠用乙醚淺麻醉后，自肛門內(nèi)置入誘發(fā)刺激直腸擴張的血管造影導管（導管上系有橡膠手指套制成的5 cm長的球囊，導管另一端通過三通閥連接血壓計和注射器），置入深度為6 cm。待大鼠蘇醒適應(yīng)20 min后，通過注射器注氣增加球囊壓力，并通過血壓計控制壓力分別為20、40、60、80 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。每個不同壓力分別重復5次，每次持續(xù)20 s，不同壓力間隔4 min。由對實驗不知情者觀察并記錄大鼠的AWR評分，評分如下：無反應(yīng)（0分）；頭部輕微晃動（1分）；腹肌收縮（2分）；腹肌收縮和抬起（3分）；腹肌強烈收縮，腹部抬起和身體拱起（4分）。

1.2.6Western blot法測定海馬、額葉皮層和回腸、結(jié)腸中BDNF蛋白表達：行為學實驗結(jié)束后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，0.9%氯化鈉溶液灌注，斷頭剝離全腦，在-40 ℃冰板上分離出海馬和額葉皮層兩個腦區(qū)。以盲腸為標志，盲腸以上4 cm切取回腸組織，以下6 cm切取結(jié)腸組織，并用冰0.9%氯化鈉溶液沖洗腸道內(nèi)容物。每個組織樣本加入500 μL含蛋白酶抑制劑（PMSF）的細胞裂解液（RIPA）（PMSF∶RIPA=1∶100）勻漿并靜置1.5 h使其充分裂解。在4 ℃，12000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，取出上清液后，在相同條件下再次離心取上清，并用BCA試劑盒測定上清液的蛋白濃度。各組樣本用裂解液和loading buffer（5×）配成4 μg/μL的體系，控制每組樣本上樣體積15 μL，12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)1 h。室溫下0.5%脫脂牛奶封閉1.5 h，用TBST稀釋后的一抗β-actin（1∶1000稀釋）、GAPDH（1∶5000稀釋）或BDNF（1∶2500稀釋）4 ℃搖床過夜?；厥找豢?，洗膜（7 min×3次）結(jié)束后倒入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG二抗（1∶10000稀釋）室溫搖床1 h，洗膜（7 min×3次）結(jié)束后ECL法顯色，條帶用Quantity one軟件分析。以目的蛋白（BDNF）與內(nèi)參蛋白（β-actin、GAPDH）的吸光度積分的比值表示蛋白的相對表達量。

1.3統(tǒng)計學處理方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，正常對照組與CACS模型組間用獨立樣本t檢驗，藥物作用采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1RES對CACS大鼠FST實驗的影響 與正常對照組比，CACS模型組大鼠的不動時間顯著增加（P＜0.01），20、40 mg/kg的RES均能明顯減少應(yīng)激后大鼠FST的不動時間，其高劑量RES作用效果與經(jīng)典抗抑郁藥物氟西?。≒＜0.01）作用相似，該結(jié)果表明高劑量的RES能夠在一定程度上改善大鼠在CACS后所呈現(xiàn)出的抑郁樣癥狀。見圖1。

圖1　各組大鼠FST不動時間比較（n=6）

2.2RES對CACS大鼠MBT實驗的影響 在MBT中，CACS模型組大鼠掩埋顆數(shù)（5.00±0.63）較正常對照組大鼠（1.67±0.52）顯著增加（P＜0.01）。在給予RES或地西泮治療后可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象（P＜0.01），且RES的作用呈劑量依賴性（P＜0.01）。同時結(jié)果也表明高劑量的RES（P＜0.01）在改善CACS大鼠焦慮樣表現(xiàn)的作用與陽性對照藥地西泮（P＜0.01）作用相似。見圖2。

圖2　各組大鼠大理石掩埋顆數(shù)比較（n=6）

2.3RES對CACS大鼠腸道動力學實驗的影響在持續(xù)21 d的慢性應(yīng)激加上第22天3 h急性束縛應(yīng)激后，CACS模型組大鼠在1 h束縛后較正常對照組的排便顆數(shù)明顯增加（P＜0.01）。給予RES（10、20、40 mg/kg）和氟西汀后，大鼠排便顆數(shù)均減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明RES在一定程度上能改善應(yīng)激大鼠腸道動力紊亂狀態(tài)。見圖3。

圖3　各組大鼠糞便顆數(shù)比較（n=6）

2.4RES對CACS大鼠內(nèi)臟敏感性實驗的影響與正常對照組大鼠相比，CACS模型組大鼠在40、60、80 mmHg壓力直腸擴張下AWR評分明顯增高（P＜0.05），表明實驗大鼠在CACS后內(nèi)臟疼痛閾值下降，腸道敏感性增加。在給予RES治療后AWR評分不同程度降低，RES在40、60、80 mmHg壓力下均能明顯逆轉(zhuǎn)CACS大鼠AWR評分增高現(xiàn)象（P＜0.05），體現(xiàn)RES在一定程度上具有改善IBS大鼠腸道高敏狀態(tài)的作用。見圖4。

圖4　各組大鼠AWR評分比較（n=6）

2.5RES對CACS大鼠海馬、額葉皮層、回腸及結(jié)腸中BDNF表達量的影響CACS模型組大鼠腦內(nèi)海馬和額葉皮層BDNF表達水平較正常對照組明顯下降（P＜0.01），而腸道內(nèi)回腸和結(jié)腸BDNF表達水平較正常對照組明顯上升（P＜0.05）。其中較高劑量（20、40 mg/kg）RES對應(yīng)激大鼠腦內(nèi)BDNF表達水平影響顯著，而低劑量RES（10 mg/kg）則對腸道內(nèi)BDNF表達水平的影響較為明顯（P＜0.01）。見圖5。

3　討論

圖5　各組大鼠不同部位BDNF表達水平比較（n=6）

IBS是臨床上常見的功能性胃腸疾病，其疼痛癥狀的持續(xù)性，病情的反復性以及常常至少伴有一種以上的精神疾病的特點導致臨床治愈難度增加，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[15]。環(huán)境因素（應(yīng)激、飲食）、遺傳因素、生物因素（感染、腸道菌群、免疫激活）等都可能誘發(fā)或加重IBS癥狀[16]，與其他疾病的高度共病性嚴重影響了IBS的診斷和治療。CAMILLERI等[17]研究指出不同分型的IBS患者（IBSD，IBS-C，IBS-M）焦慮、抑郁評分都高于健康受試者。另據(jù)報道，大量精神疾病障礙患者出現(xiàn)腸道動力異常、內(nèi)臟感覺過敏等腸道不適癥狀[18]，LIU等[19]研究表明抑郁癥患者和腹瀉型IBS患者存在相似的糞便菌群特征。IBS發(fā)病機制尚未明確，有報道指出展開針對腸道和中樞的藥物治療，加上心理治療，有助于減輕IBS關(guān)鍵癥狀[20]。目前IBS治療手段也由傳統(tǒng)的腸道對癥治療轉(zhuǎn)向包括患者精神狀態(tài)在內(nèi)的胃腸道和中樞相互關(guān)聯(lián)的整體治療[21]，這也揭示了維持腦-腸軸互動穩(wěn)態(tài)在IBS治療過程中的重要性。已有眾多研究報道多酚類化合物RES在情緒障礙疾病中的作用，其中涉及對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用[22]、抗抑郁活性[6]以及對神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防作用[23]等。結(jié)合IBS精神情緒方面的病理特點與RES的藥理作用特點，推測RES能夠改善IBS癥狀。而這一推測也被我們的研究所證實。本研究行為學結(jié)果表明，在經(jīng)過連續(xù)22 d CACS后，應(yīng)激大鼠在FST中的不動時間明顯增加（P＜0.01），大理石掩埋顆數(shù)顯著增多（P＜0.01），腸道動力測定試驗中排便顆數(shù)增加（P＜0.01），AWR評分增加（P＜0.05）。RES連續(xù)給予22 d能明顯改善應(yīng)激大鼠抑郁、焦慮癥狀，改善腸道動力紊亂狀態(tài)以及提高腸道疼痛閾值，分別體現(xiàn)在減少FST行為學中的不動時間，增加大理石掩埋顆數(shù)，減少排便顆數(shù)，降低AWR評分4個行為學中。表明RES對CACS大鼠的IBS癥狀有明顯的治療作用，在一定程度上緩解IBS大鼠的消化道紊亂癥狀和抑郁焦慮情緒。

為進一步研究RES治療IBS的分子機制，本研究檢測了BDNF在大鼠腦、腸中的表達情況。BDNF是一類能夠促進神經(jīng)元生長和存活、再生與修復的多肽或蛋白質(zhì)[24]，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要組成部分，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道組織中廣泛表達[25]。BDNF除了參與應(yīng)激相關(guān)的情緒障礙疾病的病理生理過程外[26]，同時還與維持內(nèi)臟敏感性和調(diào)節(jié)腸道動力相關(guān)[25]，但目前研究主要集中于BDNF對中樞或外周的單獨作用上，其在腦-腸傳導中的共同作用鮮有報道。GAWALI等[27]通過實驗表明慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型小鼠的焦慮、抑郁樣行為和認知障礙與低BDNF水平相關(guān)。此外有大量體內(nèi)、體外實驗證實具有抗抑郁樣作用的藥物其中一作用環(huán)節(jié)就是激活BDNF系統(tǒng)表達，改善抑郁癥狀[28]。在本研究中，Western blot結(jié)果表明BDNF在CACS大鼠海馬、額葉皮層蛋白表達明顯減少。給予22 d RES灌胃給藥后，CACS大鼠海馬和額葉皮層中BDNF表達水平顯著回升，結(jié)果與上述報道一致，提示高劑量RES可能通過提升CACS大鼠腦內(nèi)BDNF水平從而發(fā)揮抗焦慮、抗抑郁的作用，從而逆轉(zhuǎn)CACS大鼠在MBT中掩埋顆數(shù)增多，F(xiàn)ST測試中不動時間增加的行為表現(xiàn)。然而趙宏宇等[29]的研究結(jié)果表明，母嬰分離大鼠IBS模型，海馬區(qū)BDNF高表達，IBS焦慮程度提高，呈現(xiàn)與本實驗不同的研究結(jié)果。我們推測可能是由應(yīng)激不同所導致的，同時也提示IBS的病因并不是單一的，需要我們進一步的研究。無論是大鼠反復避水應(yīng)激[30]還是在CACS誘導[9]的IBS中，都有研究人員發(fā)現(xiàn)實驗大鼠糞便排出量增加并伴有結(jié)腸BDNF表達增加，而DELAFOY等[31]通過大鼠腹腔注射BDNF或BDNF抗體觀察其疼痛閾值改變情況的研究中，發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)BDNF過表達可導致疼痛閾值降低，腸道敏感性增強，以上報道分別證實IBS腸道動力紊亂、內(nèi)臟敏感性變化與BDNF表達水平異常相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mg/kg劑量RES可以逆轉(zhuǎn)IBS大鼠回腸、結(jié)腸BDNF高表達狀態(tài)，而這一結(jié)果與RES改善應(yīng)激大鼠糞便排出量與腸道高敏狀態(tài)的劑量不完全對應(yīng)，提示IBS中勢必存在更多神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)功能的損傷，RES對IBS的治療可能涉及另外的調(diào)控機制。有研究報道指出BDNF的表達水平受cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）磷酸化水平所介導[32]。胞內(nèi)cAMP水平與磷酸二酯酶活性相關(guān)[23]，且RES可通過抑制磷酸二酯酶活性上調(diào)cAMP水平，從而放大由cAMP介導的生物效應(yīng)[33]。RES對IBS大鼠腦腸BDNF系統(tǒng)的紊亂的調(diào)節(jié)作用可能與其參與調(diào)節(jié)了cAMP-CREB-BDNF系統(tǒng)有關(guān)，但仍需要進一步研究證實。在本研究中IBS大鼠腦、腸中BDNF表達水平相反，這一結(jié)果與YU等[9]的實驗結(jié)果相似，而不同劑量RES能分別逆轉(zhuǎn)BDNF在腦腸中的表達，其中可能涉及RES對腦-腸的共同調(diào)節(jié)作用，維持腦-腸互動穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，本研究采取CACS建立大鼠IBS模型，發(fā)現(xiàn)RES對IBS大鼠抑郁焦慮樣行為、腸道動力紊亂及腸道高敏狀態(tài)的改善作用可能涉及了其對“腦”“腸”中BDNF表達系統(tǒng)的調(diào)控，所影響的具體信號通路有待于深入研究。

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