林燕燕，廖婷婷，金佳希，陳佳佳，黃賢蘋，項慧秋，董克，許張曄

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院　婦產(chǎn)科，浙江　溫州　325027）

胎盤是維持胎兒生長和發(fā)育的重要器官[1-2]。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲缺陷、胎盤淺著床等是子癇前期發(fā)病的主要原因[3-4]。任何干擾人類絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移和浸潤的因素都可能導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生。整合素連接激酶（integrin linked kinase，ILK）是高度保守的大小為59 kDa的絲/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞外環(huán)境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)黏附細(xì)胞的各種生物關(guān)鍵調(diào)節(jié)過程中被發(fā)現(xiàn)[5-6]。本研究探討ILK對人滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲過程的影響，并探討其機(jī)制，為胎盤相關(guān)疾病的研究提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料TEV-1細(xì)胞株由中國香港大學(xué)TSAO教授惠贈。胎牛血清和DMEM/F-12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑TRIzol購自上海普飛公司；PCR反應(yīng)引物，ILK的siRNA序列均由上海吉凱有限公司設(shè)計合成；酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司；蛋白抽提、定量、凝膠配制試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司；Transwell試劑盒購自美國Corning公司；MTS試劑盒購自美國Promega公司；GIEMSA染色液購自美國Sigma公司；ILK、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK3β）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotease 9，MMP-9）和GAPDH抗體購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1TEV-1細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%熱滅活的FBS、25 mmol/L HEPES、100 U/mL青霉素G和100 U/mL鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基，于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯聚率達(dá)到80%～90%時用胰酶消化傳代。實驗分2組：空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（NC組）代表的是空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，ILK基因沉默組（KD組）有有效質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，沉默ILK基因。

1.2.2ILK-siRNA慢病毒構(gòu)建：由于ILK在人滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)量大，本研究用小干擾RNA靶序列轉(zhuǎn)染TEV-1細(xì)胞，沉默人滋養(yǎng)細(xì)胞中的ILK（ILK-siRNA）。ILK的siRNA序列為5’-TTGGTGCCTTCATGTAGTA-3’。滋養(yǎng)細(xì)胞接種于6孔板，用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，然后用脂質(zhì)體介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染ILK 2000。轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中收獲，在引物過濾裝置過濾并濃縮。

1.2.3qRT-PCR：按照Trizol試劑說明書提取總RNA后，依照Tiangen試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，制備相應(yīng)cDNA。按照Takara說明書操作qRT-PCR擴(kuò)增，引物序列為：GAPDH上游引物5’-TGACTTCAACAGCG ACACCCA-3’（sense），下游引物5’-CACCCTGTTGCTGT AGCCAAA-3’（antisense）；ILK上游引物5’-GACGAC ATTTTCACTCAGTGCC-3’（sense），下游引物5’-ACGGT TCATTACATTGATCCGTG-3’（anti-sense）；GSK3β上游引物5’-GCACTGTGTAGCCGTCTG-3’（sense），下游引物5’-GAGGAGGAATAAGGATGGTAGC-3’（antisense）；MMP-9上游引物5’-GCACCACCACAACATC AC-3’（sense），下游引物5’-ACCACAACTCGTCATCGTC-3’（antisense）。反應(yīng)條件為95 ℃、30 s預(yù)變性，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環(huán)，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s測定相應(yīng)溶解曲線。mRNA的相對定量分析F=2-??Ct，測定標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增效率。

1.2.4Western blot：常規(guī)消化收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，50 mg總蛋白上樣，濃縮膠80 mA、20 min；分離膠120 mA、1 h，電泳結(jié)束后，取出凝膠，300 mA 恒流電轉(zhuǎn)約150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上，轉(zhuǎn)移膜用5%脫脂奶粉室溫封閉l h后，分別加入一抗（抗ILK 1∶1000，抗GSK3β）抗體1∶1000，抗MMP-9抗體1∶1000和抗GAPDH抗體1∶1000），4 ℃反應(yīng)過夜，TBST漂洗4次，每次8 min，加入二抗，室溫下孵育PVDF膜1.5 h，并用TBST洗膜4次，每次8 min，最后電化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.5MTT法檢測細(xì)胞活力：收集各組細(xì)胞，于96孔板接種，邊緣孔用無菌PBS填充，每組設(shè)5個復(fù)孔，5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24、48、72、96和120 h后，每孔加20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)孵育4 h，每孔沿孔壁加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度值。每個實驗重復(fù)3次。

1.2.6Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力：用30 μg Matrigel膠預(yù)處理Transwell小室，在小室上部加入100 μL細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入600 μL 30% FBS培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，24 h后取出上室，Giemsa染色液到膜的下表面染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞3～5 min后，將小室浸泡沖洗數(shù)次，空氣晾干，顯微鏡拍照計數(shù)穿過濾過膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.7細(xì)胞劃痕實驗：單層TEV-1細(xì)胞培養(yǎng)過夜并用吸管尖端引入劃痕。然后用光學(xué)顯微鏡拍攝0、24 h的圖像。細(xì)胞遷移率用細(xì)胞遷移至初始無細(xì)胞區(qū)的百分比計算。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染有效質(zhì)粒后72 h，用熒光顯微鏡進(jìn)行可視化分析。結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可見綠色熒光，超過80%的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表明轉(zhuǎn)染成功，見圖1。

圖1　熒光顯微鏡下觀察TEV-1細(xì)胞（×100）

2.2基因沉默ILK后ILKmRNA和蛋白表達(dá)基因沉默ILK后，RT-PCR檢測TEV-1細(xì)胞的ILK基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示KD組TEV-1細(xì)胞ILK mRNA水平顯著下降至NC組的70%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖2A；Western blot分析顯示，基因沉默ILK顯著降低ILK蛋白的表達(dá)水平，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖2B。

圖2　ILK-siRNA對TEV-1細(xì)胞中ILK基因和蛋白表達(dá)的影響

2.3基因沉默ILK后TEV-1細(xì)胞增殖MTT比色法檢測，結(jié)果顯示在48、72和96 h，KD組與NC組比，TEV-1細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖3　MTT法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞增殖能力變化

2.4基因沉默ILK后TEV-1細(xì)胞侵襲和遷移 Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示KD組細(xì)胞的侵襲能力與NC組細(xì)胞相比顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4A。劃痕實驗檢測TEV-1細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果顯示，NC組細(xì)胞自發(fā)遷移，在8 h占據(jù)劃痕區(qū)域的31%，24 h占據(jù)100%劃痕區(qū)域。與NC組相比，KD組在8 h內(nèi)，ILK細(xì)胞的遷移能力顯著下降（P＜0.05），24 h后，劃痕區(qū)域未遷移入滋養(yǎng)細(xì)胞，見圖4B。

2.5ILK調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-9和GSK3β的水平 qRTPCR檢測TEV-1細(xì)胞的MMP-9和p-GSK3β mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示KD組TEV-1細(xì)胞MMP-9和p-GSK3β mRNA水平與NC組比顯著下降（P＜0.01），見圖5A；Western blot檢測TEV-1細(xì)胞的MMP-9和p-GSK3β蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示KD組TEV-1細(xì)胞MMP-9和p-GSK3β蛋白水平與NC組比顯著下降（P＜0.01），見圖5B。

3　討論

ILK在介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)過程之間的關(guān)系中起著重要作用。它在各種惡性腫瘤中異常表達(dá)和激活，影響細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲和血管生成[7-8]。沉默ILK基因抑制腫瘤的遷移和侵襲能力。ILK在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)上調(diào)，在位和異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞侵襲能力增加[9]。ELUSTONDO等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在整個妊娠過程，人絨毛膜組織裂解物中可檢測到ILK。ILK在ILK-Akt-Snail通路中對BeWo合成和分化發(fā)揮新作用。但很少有研究涉及ILK和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)系。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默ILK基因抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移。這些結(jié)果表明，沉默ILK基因可以干擾人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，推測ILK參與滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控，與胎兒生長受限或子癇前期發(fā)展息息相關(guān)，可能與流產(chǎn)、胎兒生長受限或先兆子癇的發(fā)病密切相關(guān)。

眾所周知，GSK3β和MMP-9是ILK信號通路中的重要調(diào)節(jié)因子。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默ILK基因可以顯著抑制靶信號GSK3β、MMP-9的表達(dá)，GSK3β、MMP-9的蛋白和mRNA水平都下降。ILK/GSK3β信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞代謝和腫瘤細(xì)胞生存的通路，抑制ILK可以降低下游信號靶蛋白GSK3β的磷酸化。LUO等[12]研究發(fā)現(xiàn)ILK通過在絲氨酸9位點磷酸化抑制GSK3β表達(dá)并抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究在滋養(yǎng)細(xì)胞沉默ILK基因之后得到相似的結(jié)果。MATSUI等[13]研究提出，ILK過表達(dá)通過控制MMP-9與膀胱癌侵襲相關(guān)。ILK過度表達(dá)可增加MMP-9的蛋白水平[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，ILK可上調(diào)MMP-9的表達(dá)，ILK-siRNA在TEV-1細(xì)胞中下調(diào)MMP-9 mRNA和蛋白水平，只有通過蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)的不同組分，滋養(yǎng)細(xì)胞才具有侵襲和遷移能力。MMP-9對滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力起著至關(guān)重要的作用。

圖5　ILK調(diào)節(jié)TEV-1細(xì)胞中的MMP-9和p-GSK3β水平

圖4　基因沉默ILK后抑制TEV-1細(xì)胞侵襲和遷移（×200）

本研究表明，沉默ILK基因可以干擾人類絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，ILK通過抑制把信號GSK3β和MMP-9的表達(dá)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移的能力。這些發(fā)現(xiàn)可能為胎盤相關(guān)疾病提供一個潛在的新的治療選擇，為胎盤相關(guān)疾病的進(jìn)一步研究和治療發(fā)現(xiàn)提供相關(guān)的參考。

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