郭芳，楊潔，陳晶晶，劉麗，陳云志，鄭飛云

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)溫州市第三臨床學(xué)院　溫州市人民醫(yī)院　婦產(chǎn)科，浙江　溫州　325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　普外科，浙江　溫州　325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　婦科，浙江　溫州325015）

試管嬰兒技術(shù)作為生殖醫(yī)學(xué)的核心技術(shù)，為絕大多數(shù)不孕癥女性帶來(lái)了福音。然而，對(duì)于那些存在先天性子宮畸形、子宮腔廣泛粘連及子宮切除術(shù)后等女性，她們?nèi)匀幻媾R著不孕的困境[1]。子宮組織再生研究無(wú)疑為子宮缺陷引起的不孕癥患者帶來(lái)了一種充滿前景的治療希望。通過(guò)去細(xì)胞化技術(shù)獲得的天然細(xì)胞外基質(zhì)支架結(jié)構(gòu)已經(jīng)在眾多器官的再生研究中發(fā)揮重要的載體作用[2-3]。本研究通過(guò)動(dòng)脈灌注途徑，結(jié)合各種去細(xì)胞化技術(shù)，成功制備天然子宮去細(xì)胞化外基質(zhì)支架，經(jīng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)和鑒定，能夠作為子宮組織再生工程的研究應(yīng)用載體。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)的健康成年雌性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中飼養(yǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009，相關(guān)的喂養(yǎng)和操作均在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

1.1.2主要試劑：0.02%胰酶（北京索萊寶科技有限公司）/0.05%EDTA（美國(guó)Sigma公司）溶液：0.25%胰酶/0.5%EDTA溶液以O(shè).1 mol/L PBS稀釋lO倍。0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS，美國(guó)Sigma公司）溶液：SDS 1 g，加1000 mL 0.1 mol/L PBS。1%曲亞通X-100（Triton-X100，北京索萊寶科技有限公司）/O.05%EDTA溶液：Triton-X10010 mL，EDTA 500 mg，加970 mL 0.1 mol/L PBS。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）的ELISA試劑盒（上海博蘊(yùn)生物科技有限公司）。組織基因組DNA提取試劑盒DP304（北京天根生化科技有限公司），羥脯氨酸測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)器材：顯微手術(shù)器械（上海金鐘金屬制品廠）；8F、24F、28F硅膠管以及橙蓋移液瓶、藍(lán)蓋瓶（海門(mén)市盛邦實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；BTl00-2J蠕動(dòng)泵（保定蘭格公司）；掃描電鏡（日本日立公司）；超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；多功能動(dòng)物手術(shù)臺(tái)（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科研究所）。

1.2方法

1.2.1大鼠子宮去細(xì)胞化支架的制作∶成年雌性SD大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉成功后，正中切開(kāi)進(jìn)腹，經(jīng)下腔靜脈注射全身肝素化后，將腸管濕紗布包裹向上推開(kāi)，顯露下腹部，腹主動(dòng)脈分出卵巢動(dòng)脈水平以下橫斷，找到髂內(nèi)動(dòng)靜脈，結(jié)扎離斷髂內(nèi)動(dòng)靜脈的其他屬支，僅保留子宮動(dòng)靜脈，經(jīng)髂內(nèi)動(dòng)脈斷端置入10號(hào)PE管直到髂內(nèi)動(dòng)脈的子宮分支開(kāi)口，妥善固定，游離管道周?chē)慕Y(jié)締組織，在子宮頸水平離斷陰道，從而完整移除包括子宮以及髂內(nèi)動(dòng)、靜脈之間的血管通路，浸沒(méi)于0.1 mol/L PBS液內(nèi)，經(jīng)-80 ℃凍融過(guò)夜，并采用優(yōu)化流程組合依次經(jīng)導(dǎo)管灌注0.02%胰酶/0.05%EDTA溶液（30 min）、3% Triton-X100/0.05% EDTA（240 min）、0.1% SDS溶液（30 min）處理后，去離子水和0.2 mol/L PBS溶液各沖洗15 min完成去細(xì)胞化流程，再經(jīng)0.01%過(guò)氧乙酸/4%乙醇溶液、青霉素/鏈霉素/兩性霉素B溶液消毒后備用。以上過(guò)程中流速均為室溫下5 mL/min，嚴(yán)格注意無(wú)菌操作。

1.2.2大體觀察：觀察新鮮子宮組織及灌注后各時(shí)間點(diǎn)（90、180、330 min）整體器官的顏色和形態(tài)學(xué)改變；灌注流程結(jié)束后通過(guò)灌注美蘭溶液（2 mL美蘭+50 mL 0.9%氯化鈉溶液）觀察去細(xì)胞化后子宮支架的脈管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

1.2.3基因組DNA含量檢測(cè)：正常子宮和去細(xì)胞化子宮支架分別取30 mg干重，經(jīng)蛋白酶K酶解后，提取基因組DNA，在260 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各樣本的DNA吸光度（OD）值，組織DNA的含量（ng/mg）按5倍的OD值計(jì)算。

1.2.4HE染色：正常子宮及去細(xì)胞化子宮支架，經(jīng)4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋、切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色：依照操作說(shuō)明對(duì)新鮮子宮和去細(xì)胞化子宮支架蠟塊組織切片中的膠原蛋白I、膠原IV、纖維連接蛋白、層粘連蛋白的表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，組織切片經(jīng)3%牛血清蛋白封閉后，分批加入以0.1 mol/L PBS按l∶200稀釋的兔抗大鼠層粘連蛋白抗體、兔抗大鼠I型膠原蛋白抗體、兔抗大鼠VI型膠原蛋白抗體、兔抗大鼠纖維連接蛋白抗體，室溫孵育2 h。滴加按1∶500稀釋的生物素化山羊抗兔二抗37 ℃孵育30 min，經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、乙醇脫水、樹(shù)膠封片后，光鏡下觀察各型蛋白的分布及含量。

1.2.6電鏡觀察：正常子宮及去細(xì)胞化子宮支架組織，分別切成1.0 mm3大小的組織塊，4 ℃ 2.5%戊二醛固定過(guò)夜，經(jīng)PBS沖洗，鋨酸后固定，一部分組織塊醋酸鈾染色，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑浸透，包埋，制作超薄切片，透射電鏡下觀察。取另一部分用PBS清洗3次，每次15 min，隨后將樣品在梯度系列乙醇中脫水，每個(gè)步驟15 min。然后將樣品臨界點(diǎn)干燥并使用Cressington Coater 108A濺射涂布機(jī)涂覆Au/Pd，掃描電鏡下觀察。

1.2.7總膠原蛋白含量檢測(cè)：準(zhǔn)確稱取80～100 mg新鮮正常子宮組織及去細(xì)胞化子宮支架組織，剪碎，水解5 h。取3～4 mL稀釋的檢測(cè)液加適量活性炭于3500 r/min離心10 min，取上清1 mL，設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管，根據(jù)要求分別按順序加入試劑1、試劑2、試劑3，60 ℃水浴15 min，冷卻后3500 r/min離心10 min，取上清于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)OD值。組織總膠原蛋白含量按羥脯氨酸的含量占總膠原蛋白含量的13.4%來(lái)估算，羥脯氨酸含量計(jì)算公式：

1.2.8ELISA法檢測(cè)EGF、bFGF、TGF-β含量：待測(cè)樣品孔加入樣本40 μL，然后分別加入抗EGF、抗bFGF和抗TGF-β抗體10 μL，均加入鏈酶親和素-HRP 50 μL，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育60 min。重復(fù)洗滌5次，甩干。每孔先加入顯色劑37 ℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次，計(jì)量資料用±s表示，2組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1去細(xì)胞化灌注入路進(jìn)腹后于右下腹找到髂外動(dòng)脈，成功置入10號(hào)PE管直到子宮動(dòng)脈分支起始處，妥善固定，并結(jié)扎離斷其余分支，見(jiàn)圖1。

圖1　灌注入路示意圖

2.2大體觀察灌注前正常子宮大體外觀呈條形管狀，表面覆蓋有薄層結(jié)締組織被膜，內(nèi)側(cè)可見(jiàn)脂肪結(jié)締組織，相互之間連接緊密。而隨著去細(xì)胞化灌注的進(jìn)行，子宮各層結(jié)構(gòu)逐漸疏松，組織逐漸變白、變透明，最后得到肉眼清晰可見(jiàn)呈透明樣的去細(xì)胞化子宮支架組織，見(jiàn)圖2。

美蘭染色后可見(jiàn)子宮支架逐步著色，美蘭由主干脈管逐步向各分支擴(kuò)散直至末端分支，去細(xì)胞化后的子宮支架脈管結(jié)構(gòu)形態(tài)完整、脈絡(luò)顯示清晰，且支架外層包膜完整保留，見(jiàn)圖3。

圖2　去細(xì)胞化灌注過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)子宮的大體變化

圖3　經(jīng)子宮動(dòng)脈灌注美蘭溶液的染色觀察

2.3組織DNA含量比較新鮮子宮組織和去細(xì)胞化后的子宮支架組織DNA含量分析結(jié)果顯示，DNA含量由新鮮子宮中的（1515.3±243.9）ng/mg降至去細(xì)胞化支架中的（45.6±7.3）ng/mg，DNA殘留量不到新鮮子宮的5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明灌注流程能夠有效地去除子宮的實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

2.4HE染色正常子宮組織在HE染色下可見(jiàn)子宮壁各層的實(shí)質(zhì)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列緊湊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞內(nèi)核深染，而胞質(zhì)著色較淺（見(jiàn)圖4A）；而去細(xì)胞化子宮支架整體呈透明“蜂窩狀”，細(xì)胞外基質(zhì)成分呈網(wǎng)格狀染色，脈管主干及微小分支結(jié)構(gòu)形態(tài)保存完整，未發(fā)現(xiàn)深染的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖4B）。

2.5膠原蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析正常子宮中可檢測(cè)到膠原蛋白I、膠原蛋白IV、纖維連接蛋白和層粘連蛋白。經(jīng)去細(xì)胞后獲得的子宮支架，上述4種主要膠原蛋白成分均保存完好，且各型膠原蛋白所形成的纖維網(wǎng)絡(luò)形態(tài)與正常子宮基本一致，見(jiàn)圖5。說(shuō)明本研究的灌注流程能夠完整保留細(xì)胞外基質(zhì)的各種膠原成分。

2.6總膠原蛋白含量比較總膠原蛋白含量結(jié)果顯示，與新鮮子宮組織[（0.57±0.12）μg/mg]比較，去細(xì)胞化子宮支架的羥脯胺酸含量[（0.88±0.10）μg/mg]明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明去細(xì)胞化后子宮支架內(nèi)的膠原蛋白保留情況比較滿意。

圖5　各型膠原蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.7電鏡觀察正常子宮掃描電鏡下可見(jiàn)實(shí)質(zhì)細(xì)胞緊密排列，透射電鏡下細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞核邊界清晰，基底膜完整，間隙較窄。而去細(xì)胞化后掃描電鏡下可見(jiàn)清晰的脈管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包含細(xì)胞外基質(zhì)的各型膠原蛋白和基底膜，透射電鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)大型細(xì)胞器均已消失，見(jiàn)圖6。

2.8EGF、bFGF、TGF-β含量比較為了評(píng)估去細(xì)胞化后子宮支架的生物活性，檢測(cè)了新鮮子宮組織和去細(xì)胞化子宮支架中EGF、bFGF、TGF-β的含量。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)去細(xì)胞灌注，支架中EGF、bFGF、TGF-β的含量較新鮮組織有所下降，但仍然保留了大部分，其中TGF-β保留了54%，EGF保留了66%，而bFGF保留了85%，見(jiàn)圖7。說(shuō)明我們制備的去細(xì)胞化子宮支架仍具有較好的生物活性。

圖6　正常子宮和去細(xì)胞化子宮支架的掃描電鏡和透射電鏡觀察結(jié)果

圖7　正常子宮和去細(xì)胞化子宮支架中EGF、bFGF、TGF-β含量檢測(cè)結(jié)果

3　討論

子宮移植雖然在臨床上的應(yīng)用才處于新興起步階段，但是對(duì)于因子宮缺如或子宮功能缺陷而不孕的女性，子宮移植相比代孕等其他方式，更符合醫(yī)學(xué)道德倫理的需要[4]。但是供體的嚴(yán)重缺乏、免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題限制了子宮移植的臨床應(yīng)用。近年來(lái)，去細(xì)胞化支架技術(shù)作為組織再生工程的核心技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于器官的重建和再造研究。由于去細(xì)胞化生物支架獲取的天然細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)于介導(dǎo)細(xì)胞分化與成熟時(shí)所需的生物物理刺激、生物化學(xué)信號(hào)傳遞以及空間立體結(jié)構(gòu)的形成具有極其重要的作用[5]，目前利用去細(xì)胞化技術(shù)，已經(jīng)分別實(shí)現(xiàn)了心、肝、腎以及肺等器官的去細(xì)胞與再重建的研究[6-9]。而針對(duì)子宮的去細(xì)胞化支架的制備及其應(yīng)用研究在國(guó)內(nèi)外都少有報(bào)道，本研究運(yùn)用去細(xì)胞化技術(shù)，優(yōu)化灌注策略，成功制備天然的大鼠子宮去細(xì)胞化支架，經(jīng)過(guò)全面的評(píng)價(jià)，可作為子宮組織再生工程研究良好的生物載體。

有研究報(bào)道去細(xì)胞化支架制作成功的關(guān)鍵包含兩方面，一方面要徹底洗脫出灌注主體內(nèi)的細(xì)胞及細(xì)胞結(jié)構(gòu)殘留物，另一方面則是盡可能地保留灌注主體內(nèi)部的細(xì)胞外基質(zhì)成分[10]。傳統(tǒng)的去細(xì)胞化流程側(cè)重機(jī)械攪動(dòng)及凍融破碎的方法，去細(xì)胞化效能低，且尚不能保證可以完整保留細(xì)胞外基質(zhì)成分，隨著去細(xì)胞化技術(shù)的日益發(fā)展，物理法、化學(xué)試劑、酶學(xué)法、滲透壓法等不同方法可以多元組合，達(dá)到不同的去細(xì)胞效果[8，11-12]。結(jié)合目前的報(bào)道我們認(rèn)為，灌注前的凍融操作及胰蛋白酶水解是必要的，化學(xué)試劑主要為SDS和TritonX-100，SDS是離子型洗脫劑，對(duì)腎臟、心臟等組織較厚的器官更有效，而TritonX-100是去離子型洗脫劑，對(duì)血管、皮膚等較薄的組織效率更高[13]。因?yàn)閮烧邔?duì)細(xì)胞外基質(zhì)均具有一定的破壞力，因此兩者的灌注比例如何組合較為關(guān)鍵。UYGUN等[14]以不同濃度梯度的SDS作為洗脫劑，成功制備了大鼠全肝臟去細(xì)胞化支架，但去細(xì)胞化效能較低，用時(shí)較長(zhǎng)，達(dá)5 d，而且SDS做為一種離子型洗脫劑對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞也相當(dāng)大。此后，SOTO-GUTIERREZ等[15]提出了新的去細(xì)胞化灌注洗脫策略，他們以3%的TritonX-100作為主要試劑，結(jié)果表明TritonX-100作為一種較溫和的非離子型洗脫劑不僅達(dá)到與SDS相近的去細(xì)胞效果，同時(shí)也相應(yīng)地減少了對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的破壞。因此，本研究中為了盡可能減少洗脫劑對(duì)支架的損害，選定以TritonX-100作為主要洗脫劑，聯(lián)合SDS短時(shí)間灌注的灌注洗脫策略。

對(duì)獲得的去細(xì)胞化支架的鑒定和評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，HE染色未見(jiàn)支架內(nèi)細(xì)胞及細(xì)胞殘?bào)w，組織DNA含量比較分析顯示去細(xì)胞化后DNA含量為（45.6±7.3）ng/mg，較正常子宮顯著降低。細(xì)胞外基質(zhì)成分是促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖的重要媒介，是去細(xì)胞化支架具備天然生化特性的基礎(chǔ)，而我們對(duì)總膠原蛋白含量的檢測(cè)及4種主要膠原成分的免疫組織化學(xué)分析表明，去細(xì)胞化后支架內(nèi)部的細(xì)胞外基質(zhì)成分均能完整保留。而美蘭染色和電鏡觀察結(jié)果也顯示了去細(xì)胞化后支架內(nèi)部清晰的脈管網(wǎng)絡(luò)和空間微環(huán)境，進(jìn)一步證明了支架內(nèi)部特有的物理性能。此外，有多個(gè)研究表明細(xì)胞外基質(zhì)還包含促進(jìn)細(xì)胞黏附和組織結(jié)構(gòu)整合、修復(fù)、增生的許多生長(zhǎng)因子和生物誘導(dǎo)因子[16-17]。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)支架的生物活性，我們檢測(cè)了支架內(nèi)部生長(zhǎng)因子EGF、bFGF、TGF-β含量，結(jié)果表明去細(xì)胞化支架能夠較好地保留其內(nèi)部EGF、bFGF、TGF-β等生物活性因子，這些生長(zhǎng)因子在血管生成中是必需的，能夠促進(jìn)血管發(fā)生、細(xì)胞發(fā)育、神經(jīng)元生長(zhǎng)和再生免疫調(diào)解[18]。

綜上分析，我們的去細(xì)胞化策略能夠成功制備理想的去細(xì)胞化子宮支架，并且該支架保留了促進(jìn)細(xì)胞分化、成熟的細(xì)胞外基質(zhì)和脈管微環(huán)境，具有良好的生物活性，能夠作為子宮組織再生工程研究領(lǐng)域中良好的應(yīng)用載體，未來(lái)亦有望以去細(xì)胞化支架為基礎(chǔ)重建再生子宮組織，為子宮缺陷引起的不孕癥患者提供一種可能的治療方式。

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