茹正良，吳明義，景孟軍

血小板是多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的儲(chǔ)存庫(kù)，這些細(xì)胞生長(zhǎng)因子能促進(jìn)血液凝固、組織修復(fù)和骨化過(guò)程。富含血小板血漿（PRP）是少量的血漿內(nèi)包含大量的血小板成分的血制品，PRP通過(guò)生長(zhǎng)因子例如血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 等起促進(jìn)成骨[1-3]，已成功應(yīng)用于下頜骨和脊柱的骨移植手術(shù)、心血管手術(shù)和相關(guān)的代謝性骨疾病等[4]。以往研究中PRP應(yīng)用于促進(jìn)扁骨和松質(zhì)骨骨折愈合，而且缺乏載體，本實(shí)驗(yàn)研究PRP承載在明膠上對(duì)長(zhǎng)骨粉碎性骨折的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1動(dòng)物、試劑材料

1.1.1健康成年大鼠40只，雌雄不限，體質(zhì)量400～600 g，均購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2試劑 抗凝劑枸櫞酸鈉（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)中心）；BMP-2、VEGF抗體、凝血酶（杭州厚愛(ài)生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3材料 克氏針、鋼絲鋸、青霉素、注射器、血管鉗、復(fù)合碘、一次性無(wú)菌巾、無(wú)菌手套、無(wú)菌敷料、線剪、手術(shù)刀及縫合用針線等（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供）。

1.2方法 將40只大鼠中4只作為取血源，剩下36只大鼠用隨機(jī)數(shù)字法分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組18只。

1.2.1PRP明膠制作 殺死4只大鼠，取全血60 ml，分別加入含有枸櫞酸鈉溶液的試管中，采用二次離心方法制備PRP。1 500 r/min離心20 min，巴氏管吸取上部的血漿及靠近界面1mm的紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一離心管中。進(jìn)一步2000 r/min離心10min，可見(jiàn)在底部薄層的紅細(xì)胞上沉積有白膜樣物質(zhì)，即為血小板沉積層；其上部為含有極少量未沉降血小板的血漿層。巴氏管吸取上部大部分血漿，剩下約0.5 ml血漿及血細(xì)胞成分。靜置30 min后輕輕振搖離心管，使紅細(xì)胞和血小板重懸于剩余的血漿中，即為PRP，最終得到全部的PRP 5 ml。將明膠海綿裁剪成0.5 cm小條，浸泡于PRP液中，即得到富PRP明膠。

1.2.2動(dòng)物模型制備 36只大鼠行頭部及四肢固定于操作臺(tái)上，取右后肢常規(guī)方法脫毛滅菌，于脛骨中段處行長(zhǎng)3 cm縱行切口，沿肌間隙游離脛骨，切開(kāi)骨間膜及骨膜，近似橫行鋸斷脛骨，人為造成一處蝶形骨片，直視下遠(yuǎn)近斷端完全分離，利用克氏針倒打釘技術(shù)復(fù)位并同時(shí)固定骨折斷端，沖洗創(chuàng)面，實(shí)驗(yàn)組骨折線處覆上PRP明膠，對(duì)照組骨折處覆蓋空白明膠，逐層縫合，無(wú)菌紗布包扎。術(shù)后即下地，青霉素肌注3 d，隔日換藥，2周拆線。兩組大鼠分別在建模后1、2及4周行X線檢測(cè)，擬每個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組分別取6只行X線評(píng)價(jià)。

1.3觀察指標(biāo) 骨痂X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：骨折斷端表現(xiàn)未見(jiàn)骨痂為Ⅰ級(jí)（0分）；斷端邊緣模糊，其骨膜反應(yīng)較淺淡，有少量骨痂，密度淡，邊緣不平整為Ⅱ級(jí)（1分）；斷處邊緣已接近消失但仍可見(jiàn)，骨膜反應(yīng)深，其骨痂量增多，未達(dá)到將缺損填滿，邊緣較清晰，密度增加為Ⅲ級(jí)（2分）；斷處邊緣已完全消失，其骨膜反應(yīng)密度已近似骨影，缺損被骨痂填滿，并與骨皮質(zhì)密度一樣且相互連接為Ⅳ級(jí)（3分）。免疫組化檢測(cè)：第1周大鼠死亡6只，第2周死亡2只。第1周分別取5、4只，第2周分別取5、5只，第4周取4、5只。將X線檢查后實(shí)驗(yàn)大鼠殺死，以骨折斷端為中心取長(zhǎng)2.0～3.0 cm的骨組織標(biāo)本作免疫組化檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組骨痂大體形態(tài) 建模后對(duì)照組1只出現(xiàn)感染，3只（對(duì)照組2只，實(shí)驗(yàn)組1只）傷口局部出現(xiàn)輕度的紅腫，應(yīng)用抗生素和傷口換藥處理后愈合良好，其余未發(fā)現(xiàn)傷口局部異常情況；兩組在建模后1、2周時(shí)，均有不同程度纖維連接形成，第4周出現(xiàn)明顯骨痂；前2周大鼠骨折部位以纖維連接為主，實(shí)驗(yàn)組的纖維連接強(qiáng)于對(duì)照組，兩組骨折線清晰，無(wú)明顯的骨痂生成；4周時(shí)兩組骨折線模糊，僅少量骨折部位骨折線清晰，骨折部位存在不等量的骨痂，且實(shí)驗(yàn)組多于對(duì)照組。

2.2X射線檢測(cè)結(jié)果 建模后第1周兩組均無(wú)明顯的骨痂形成，兩骨折斷面清晰。第2、4周連續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨折斷端逐漸模糊，骨痂影逐漸的增大，骨折部位出現(xiàn)了硬性骨痂。實(shí)驗(yàn)組 X線評(píng)分（2.80±0.47）分，對(duì)照組（2.25±0.50）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=7.95＜ 0.05）。

2.3免疫組化結(jié)果 根據(jù)大鼠處死時(shí)間分為第一批、第二批及第三批。兩組第一批、第二批及第三批大鼠骨標(biāo)本中BMP-2、VEGFA含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）；隨著時(shí)間推移，第三批BMP-2、VEGFA含量達(dá)到最高。見(jiàn)表1～2。

3　討論

本組采用二次離心方法制備PRP明膠，這種制備方法成熟簡(jiǎn)便、易于操作，要求在盡可能無(wú)菌條件下完成，在制備的過(guò)程中盡可能減少不必要操作。明膠具有良好的生物相容性、生物降解性、骨傳導(dǎo)性及免疫原性低，有一定的強(qiáng)度及初性、高孔隙率。PRP承載于明膠能有效防止PRP流失，使細(xì)胞因子持續(xù)作用于骨折斷端。殺死大鼠取全血過(guò)程中，可能混雜有其他成分，這需要提高操作精度或者提升工藝來(lái)提純。

本研究動(dòng)物模型取大鼠后肢脛骨中段，造成脛骨粉碎性骨折模型，這種骨折模型操作相對(duì)單純，更加符合臨床實(shí)際運(yùn)用，易于在直視下將PRP明膠植入骨折部位并可以觀察植入情況。骨折模型建立后行克氏針內(nèi)固定，這在解剖基礎(chǔ)上能夠加強(qiáng)骨折部位穩(wěn)定性，比石膏夾板外固定更加可靠。筆者在造模中碰到的主要問(wèn)題是骨折類型的不一致，目的是大致橫斷骨折加一個(gè)蝶形骨片，橫斷骨折因?yàn)橛娩徸舆€是很容易達(dá)成，但是用暴力制造蝶形骨片還是碰到了困難，很容易造成骨片的粉碎，后來(lái)臨時(shí)增加大鼠補(bǔ)足了實(shí)驗(yàn)數(shù)目。

表1　骨痂中BMP-2含量表 g

表2　骨痂中VEGFA含量表 g

因?yàn)楣钦鄣男迯?fù)經(jīng)歷血腫形成、血腫機(jī)化、骨痂形成和骨痂改建4個(gè)階段。當(dāng)成骨大于或等于破骨的時(shí)候，骨損傷的修復(fù)過(guò)程才能順利進(jìn)行，當(dāng)骨的穩(wěn)定受到破壞時(shí)，則需要新生骨組織修復(fù)創(chuàng)傷造成的缺損，此時(shí)可見(jiàn)大量毛細(xì)血管自骨折端長(zhǎng)出，為骨修復(fù)提供所需的因子、細(xì)胞及養(yǎng)料，直至軟骨基質(zhì)骨化并進(jìn)一步形成骨組織[5]。在骨的生長(zhǎng)及修復(fù)過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白（BMP）是一類具有骨誘導(dǎo)性的因子，其中BMP-2是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 家族成員之一，具有誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)肝細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向轉(zhuǎn)化與增殖能力，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，參與骨和軟骨生長(zhǎng)發(fā)育及其重建過(guò)程，進(jìn)而加速骨折修復(fù)[6]。VEGF為特征性的內(nèi)皮性生長(zhǎng)因子，在體內(nèi)體外，正常生長(zhǎng)發(fā)育和病理過(guò)程中都可以特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)血管生成，包括內(nèi)皮及內(nèi)皮源性細(xì)胞、軟骨及骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞都可以分泌VEGF，其家族成員有VEGFA、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（PLGF），VEGF-B、-C、-D和E[7]。通常所熟悉的VEGF—般是指VEGF-A，廣泛分布于各種組織以骨及心臟組織數(shù)量最多，有多種亞型，每種亞型都有各自不同的生物性能在血管生成中發(fā)揮相應(yīng)作用[8]。

BMP對(duì)成骨的誘導(dǎo)為級(jí)聯(lián)過(guò)程，大致可分為4個(gè)階段[9]：（1）趨化階段。植入后0～3 d，局部基質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)、行為和數(shù)量出現(xiàn)改變；（2）分化階段。植入后4～l0d，基質(zhì)干細(xì)胞開(kāi)始分化，可觀察到軟骨類細(xì)胞出現(xiàn)如軟骨祖細(xì)胞，伴隨多種結(jié)締組織細(xì)胞的遷移；（3）骨質(zhì)形成階段。軟骨基質(zhì)在植入后10～20d開(kāi)始合成，并在植入物的有血管區(qū)發(fā)生軟骨內(nèi)成骨，出現(xiàn)骨細(xì)胞并有沉積形成新生編織骨，軟骨組織形成于無(wú)血管區(qū)；（4）改建階段。植入后2～30d，新生骨趨于成熟，編織骨不斷重塑逐漸形成具有骨髓的板層骨。選擇第1、2及4周符合骨誘導(dǎo)周期，能更好地觀察其中的改變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 PRP具有明顯的促進(jìn)骨折愈合作用，這顯示PRP作為自體生物材料優(yōu)勢(shì)。首先，取材特別廣泛，價(jià)格低廉；其次，具有很強(qiáng)安全性，能夠減少植入材料引起的一系列并發(fā)癥如疾病傳播和免疫反應(yīng)等；另外，其制備過(guò)程簡(jiǎn)單、易于操作。這些優(yōu)勢(shì)決定了PRP應(yīng)用前景，但由于當(dāng)前備PRP制備方法不同而導(dǎo)致了不同結(jié)果，這就對(duì)PRP作用產(chǎn)生很大爭(zhēng)議，限制了PRP應(yīng)用前景。很多專家學(xué)者僅對(duì)單一細(xì)胞因子或2種細(xì)胞因子對(duì)骨折愈合或軟組織愈合作用影響進(jìn)行研究，但少量卻種類眾多細(xì)胞因子對(duì)骨折局部共同作用機(jī)制仍不清楚，目前需要進(jìn)一步完善PRP中細(xì)胞因子種類檢測(cè)及相關(guān)作用以及對(duì)骨折愈合過(guò)程作用（協(xié)同效應(yīng)或抑制效應(yīng)）。需進(jìn)一步明確PRP應(yīng)用于臨床后，在骨折局部持續(xù)具體時(shí)間，以及局部產(chǎn)生反應(yīng)及如何反應(yīng)等。伴隨著上述一系列問(wèn)題解決，PRP將進(jìn)一步應(yīng)用于臨床并取得良好效果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫濤,欒景杰,高復(fù)峪,等.富血小板血漿對(duì)四肢粉碎性骨折患者骨折愈合的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2016,13(36):117-119.

[2] Welbrich G,Kleis WK,Hafner G,et al.Growth factor levels in the platelet-rich plasma and correlations with donor age,sex,and plateletcount[J].JCraniomaxillofac Surg,2002,30(2):97-102.

[3] Sánchez AR,Sheridan PJ,Kupp LI.Is platelet-rich plasmatheperfect enchmancementfactor?Acurrentreview[J].Int JOral Maxillofac Implants,2003,18(1):93-103.

[4] Richmond JC.Arthroscopy classics.Vascularity for healing of meniscus repairs.Arthroscopy[J].2010.26(10):1368-1369.

[5] Vascellari A,Rebuzzi E,Schiavetti S,etal.All-insidemeniscal repair usingthe FasTFix meniscal repair system:isstill needed to avoid weight bearing?A systematic review[J].Muscxiloskelet Surg,2012,96(3):149-154.

[6]Chen G,Niemeyer F,Wehner T,etal.Simua tion of thenutrient supply in fracturehealing[J].JBiomech.2009,42(15):2575-2583.

[7] Ferrara N.Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis[J].Kidney Int.1999,56(3):794-814.

[8] LeeYH,Nyland J,Burden R,etal.Cyclic test comparisonof all-insidedeviceand insideoutsuturesfor radial meniscuslesion repair:an in vitro porcinemodel study[J].Arthroscopy.2012.28(12):1873-1881.

[9] Gao SG,Liu H,Li KH,etal.Effectof epime dium pubescen flavonoid on bonemineral statusandboneturnoverinmaleratschronically exposed to cigarette smoke[J].BMC Mus culoskelet Disord,2012,19(13):105.