李偉龍，孟越，余霄，龐清江

甲狀旁腺素（PTH）是公認的促骨形成藥物[1]。既往研究表明，PTH可以顯著增加小鼠股骨、脛骨和全身的骨密度，脛骨骨礦物含量也明顯增加[2]。在一項大樣本的臨床研究中，PTH可以顯著增加絕經(jīng)后女性椎體、股骨頸的骨密度，明顯降低骨折風險，背痛癥狀也顯著減輕[3]。能否將其促進骨形成的作用運用到骨折愈合期來加速患者的康復(fù)是目前的研究熱點，但是PTH連續(xù)大劑量促進骨吸收和間斷小劑量促進骨形成的雙向骨調(diào)節(jié)機制導致PTH并沒有達到理想中的效果[4]。本研究將觀察不同甲狀旁腺素模擬肽對于去勢雌性小鼠骨折愈合的影響，為開發(fā)基于PTH更有效、副作用更少的促骨形成藥物提供理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.2動物模型的建立 按照經(jīng)典的切除雙側(cè)卵巢的方法建立骨質(zhì)疏松模型[5]。術(shù)后連續(xù)3d腹腔注射青霉素（80000U/kg）。將去勢的小鼠常規(guī)飼養(yǎng)4周后，異氟烷（300 ml/min）吸入麻醉后，左側(cè)大腿備皮、皮膚消毒，參考小鼠股骨骨折模型相關(guān)的文獻[6]，于左大腿后外側(cè)作1.5 cm的切口，鈍性分離肌肉及軟組織，暴露股骨，從膝關(guān)節(jié)處逆行插入直徑為0.45mm鋼針進行髓內(nèi)固定，直視下用手術(shù)刀（15#）切斷股骨中下1/3段部分，造成橫行骨折。術(shù)畢縫合切口。術(shù)后連續(xù)3天腹腔注射青霉素（80 000 U/kg），術(shù)后定時觀察傷口愈合情況。

1.3藥物治療 動物模型建立后，將所有小鼠隨機分成3組，每組16只，使用相應(yīng)的藥物進行皮下注射。PTH（1-28）組（400 g/kg），PTH（1-34）組（40 g/kg）及對照組（等劑量0.9%氯化鈉注射液），每周5 d，連續(xù)4周。本實驗的PTH的劑量以文獻[7]為參考。在骨折術(shù)后的2周和4周分別處死各組小鼠8只，收集左側(cè)股骨進行檢測。

1.4骨痂處Micro-CT檢查 將左側(cè)股骨分離，剝離周圍的軟組織及肌肉，并拔除鋼針，將整段股骨浸泡在10%的甲醛48 h，后取出放在 70%的酒精保存在4℃，取左側(cè)股骨進行 Micro-CT掃描（skyscan1176，Bruker，USA），股骨用濕潤的紙巾包裹，放入樣本掃描固定器中，確保股骨長軸和掃描器長軸一致，掃描參數(shù)設(shè)定：選定全部骨痂區(qū)域，50kV，98 A，每層厚度9 m，掃描結(jié)束后運用Micro-CT自帶軟件進行新生骨痂區(qū)域的選定，并對以下參數(shù)進行量化統(tǒng)計：骨密度（BMD）、骨體積（BV）、相對骨體積（BV/TV）、平均骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.5生物力學檢測 進行骨 Micro-CT掃描后的股骨，進行三點彎曲測試。選取支點跨距為6mm，在骨痂中點處垂直施加載荷，速率為2mm/min。發(fā)生骨折時記錄下最大力，根據(jù)力與位移曲線計算出剛度。本實驗過程均由試驗機（Instron E1000，Instron，Norwood，MA，USA）自帶軟件進行記錄、分析。

1.6統(tǒng)計方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析或LSD-檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1BMD值 術(shù)后2周和4周，PTH（1-34）組的BMD值均高于PTH（1-28）組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（=3.56、12.48，均＜0.05）；術(shù)后 4 周，PTH（1-28）組的BMD高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（=2.32＜0.05）。見表 1。

2.2Micro-CT數(shù)據(jù) 術(shù)后2周和4周，PTH（1-28）組和 PTH（1-34）組的 BV 值均高于對照組（均＜0.05）；從術(shù)后2周、4周，每組的BV值均逐漸在下降，且PTH（1-28）組和 PTH（1-34）組的 BV 值在各個時間點差異均有統(tǒng)計學意義（均＜0.05）。見表2。

目前淮山的加工產(chǎn)品主要有鮮切淮山、速凍淮山、淮山干制、淮山果蔬復(fù)合飲料、淮山保健酸奶、淮山焙烤食品、速溶淮山粉等。

術(shù)后2周和4周，PTH（1-34）組的BV/TV值均高于對照組（=3.51、4.10，均＜0.05）；術(shù)后2周，對照組與 PTH（1-28）組的BV/TV差異無統(tǒng)計學意義（=1.33＞0.05）；術(shù)后 4 周，PTH（1-34）組與PTH（1-28）組的BV/TV差異有統(tǒng)計學差異（=2.53＜0.05）。見表3。

術(shù)后2周和4周，PTH（1-28）組和PTH（1-34）組的Tb.Th值均高于對照組（均＜0.05）；PTH（1-34）組與PTH（1-28）組的術(shù)后2周Tb.Th差異無統(tǒng)計學意義（=2.01，＞0.05）；兩組術(shù)后4周Tb.Th差異有統(tǒng)計學意義（=3.08，＜0.05）。見表4。

2.3生物力學數(shù)據(jù) 術(shù)后2周和4周，PTH（1-28）組和 PTH（1-34）組的剛度和最大力均明顯高于對照組（≥17.017，均＜ 0.05）；術(shù)后 2 周，PTH（1-34）組的剛度(10.1±0.8)N/m 和最大力（5.0±0.7）N 均明顯高于PTH（1-28）組的剛度（8.6±0.7）N/m 和最大力（4.3±0.5）N（ =2.60、3.82，均＜ 0.05）；術(shù)后 4 周，PTH（1-34）組的剛度（17.0±2.8）N/m和最大力（8.9±1.1）N均明顯高于 PTH（1-28）組的剛度（14.2±2.7）N/m和最大力（7.0±1.0）N（=2.41、4.26，均＜0.05)。

3　討論

雌性小鼠切除雙側(cè)卵巢制作骨質(zhì)疏松模型已廣泛應(yīng)用于骨折愈合領(lǐng)域的研究[5]，本文參考相關(guān)的小鼠骨折模型的建立方法[6]，對去勢小鼠行股骨中下1/3段橫行截骨，成功制作骨質(zhì)疏松性骨折的小鼠模型。

PTH對維持人體內(nèi)鈣磷調(diào)節(jié)的平衡起到重要作用，2002年美國FDA批準低劑量PTH間斷性皮下注射治療骨質(zhì)疏松[7]，2010年P(guān)TH被批準進入中國市場，治療女性絕經(jīng)后重度骨質(zhì)疏松。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，年紀大于50歲的白種人群中，有50%的女性和20%的男性在今后的一生中會發(fā)生脆性骨折[8]。因此，如何將其有效地應(yīng)用到骨質(zhì)疏松性骨折的患者中是目前臨床和基礎(chǔ)研究的熱點。但是由于PTH的雙向調(diào)節(jié)作用使PTH的促骨形成作用并沒有達到預(yù)期的療效[4]。這主要是由于 PTH可以通過激活PTHR1受體（G蛋白結(jié)合受體），從而激活多個信號通路，目前與成骨相關(guān)的幾個信號通路包括cAMP/PKA、PLC/PKC和非PLC/PKC信號通路[9]。既往研究顯示，cAMP/PKA信號通路是PTH促進骨形成的主要機制，PLC/PKC沒有促進骨形成的作用，主要是輔助cAMP/PKA的破骨作用[10-11]；前期研究發(fā)現(xiàn)，非PLC/PKC信號通路可以促進受力區(qū)松質(zhì)骨的形成，進而促進新骨形成[12]。本實驗研究顯示，PTH（1-34）具有天然的甲狀旁腺素的所有活性，可以激活上述三條通路；PTH（1-28）則去除了PTH(29-34)肽段，導致PTH（1-28）只能激活cAMP/PKA和PLC/PKC信號通路[13-14]。

Micro-CT數(shù)據(jù)顯示，術(shù)后2周和4周，PTH（1-34）組的BMD值明顯均高于PTH（1-28）組，而 PTH（1-28）相比于對照組，也能明顯提高骨痂的BMD值（均＜ 0.05）；術(shù)后 2 周和 4 周，PTH（1-34）相較于其他組均具有較高的BV/TV值；術(shù)后 2周，PTH（1-28）組和PTH（1-34）組具有較高的BV；術(shù)后2周和4周，PTH（1-28）組和PTH（1-34）組均具有較高Tb.Th，且PTH（1-34）組均優(yōu)于PTH（1-28）組（均＜0.05）。表明PTH可以提高骨折部位的骨組織平均密度并增加骨量，同時能夠促進骨小梁的微結(jié)構(gòu)的改變，說明PTH可以通過激活PTHR1受體促進小鼠骨折部位骨痂的形成和重塑[15]。同時，PTH（1-28）組在促進骨折愈合方面也具有較好的功效，可能是由于PTH（1-28）激活了能產(chǎn)生主要促骨形成作用的 cAMP/PKA信號通路，PTH（1-34）組在促進骨量增加方面優(yōu)于PTH（1-28）組（＜0.05），鑒于該兩種甲狀旁腺素模擬肽激活的通路的差異，推測兩種模擬肽在骨折愈合的差別可能是由于PTH（1-34）在激活cAMP/PKA和PLC/PKC信號通路的基礎(chǔ)上，還能額外激活非PLC/PKC信號通路以增加骨痂的骨量和骨密度。

骨折愈合是一個十分復(fù)雜的過程，受到自身和外界等多方面因素的影響，骨折愈合的臨床標準除了骨痂的連續(xù)和骨折線的模糊，還需要骨折部位恢復(fù)到一定的強度。本組術(shù)后2周和4周，PTH（1-34）組和PTH（1-28）組的剛度和最大力均明顯高于對照組，且PTH（1-34）組優(yōu)于 PTH（1-28）組（均＜ 0.05）?？梢奝TH（1-34）和 PTH（1-28）均可恢復(fù)骨折力學穩(wěn)定和強度，而PTH（1-28）在恢復(fù)力學穩(wěn)定上稍差于PTH（1-34）。結(jié)合之前的Micro-CT結(jié)果，推斷PTH在促進骨折愈合過程中之所以具有較好的生物力學性能，在早期，可能是通過增加骨量來增強骨痂的力學性能，到了后期則主要通過對骨痂的改建和重塑來恢復(fù)骨折處骨痂的力學；而鑒于PTH（1-34）組的生物力學性能亦明顯優(yōu)于 PTH（1-28）組，故推斷可能是PTH（1-34）通過非PLC/PKC信號通路能夠在骨質(zhì)疏松性骨折的愈合過程中對骨微結(jié)構(gòu)進行改建和重塑以恢復(fù)骨折的力學穩(wěn)定及強度。

表1　術(shù)后2周和4周3組BMD值

表2　術(shù)后2周和4周3組BV值 mm3

表3　術(shù)后2周和4周3組BV/TV值 %

表4　術(shù)后2周和4周3組Tb.Th值 m

本實驗也有以下不足之處：一是樣本量較少，二是本研究的觀察時間只有4周。PTH對于骨質(zhì)疏松性骨折愈合的后期療效如何還有待更長時間的研究觀察。

參考文獻：

[1] Phetfong J,Sanvoranart T,Nartprayut K,et al.Osteoporosis:the current status of mesenchymal stem cell-based therapy[J].Cell Mol Biol Lett,2016,21(3):12.

[2]Okubo N,Fujiwara H,Minami Y,et al.Parathyroid hormone resets the cartilage circadianclock of theorgan-cultured murine femur[J].Acta Orthop,2015,86(5):627-631.

[3] Hegde V,Jo JE,Andreopoulou P,etal.Effect of osteoporosis medications on fracture healing[J].Osteoporos Int,2016,27(3):861-871.

[4] Drake MT,Srinivasan B,Modder UI,et al.Effectsof intermittent parathyroid hormone treatment on osteoprogenitor cells in postmenopausal women[J].Bone,2011,49(3):349-355.

[5]Chow SK,Leung KS,Qin J,et al.Mechanical stimulation enhanced estrogen receptor expression and callus formation in diaphyseal long bone fracture healing in ovariectomy-induced osteoporotic rats[J].Osteoporos Int,2016,27(10):2989-3000.

[6] Feron JM,Mauprivez R.Fracture repair:general aspectsand influenceof osteoporosis and anti-osteoporosis treatment[J].Injury,2016,47 Suppl 1:S10-14.

[7]Dede AD,Makras P,Anastasilakis AD,Investigational anabolic agents for the treatment of osteoporosis:an update on recent developments[J].Expert Opin Investig Drugs,2017,26(10):1137-1144.

[8] Chakraborty C,Doss CG.Crucial protein based drug targets and potential inhibitors for osteoporosis:new hope and possibilities[J].Curr Drug Targets,2013,14(14):1707-1713.

[9] Leder BZ.Parathyroid hormoneand parathyroid hormone-related protein analogs in osteoporosis therapy[J].Curr Osteoporos Rep,2017,15(2):110-119.

[10]Guo J,Liu M,Yang DH,etal.Phospholipase C signaling via the parathyroid hormone(PTH)/PTH-related peptidereceptor is essential for normal bone responses to PTH[J].Endocrinology,2010,151(3):3502-3513.

[11]Wang J,Gilchrist A,Stern PH.Antagonist minigenes identify genes regulated by parathyroid hormone through G proteinselective and G protein co-regulated mechanisms in osteoblastic cells[J].Cell Signal,2011,23(6):380-388.

[12]Yang D,Guo J,Divieti P,etal.Parathyroid hormone activates PKC delta and regulates osteoblastic differentiation via a PLC independent pathway[J].Bone,2006,38(7):485-496.

[13]Gensure RC.Parathyroid hormone-related peptide and the hair cycle,is it the agonistsor theantagoniststhatcausehair growth[J]?Exp Dermatol,2014,23(12):865-867.

[14]Yang DH,Singh R,Divieti P,et al.Contributions of parathyroid hormone(PTH)/PTH-related peptide receptor signaling pathwaysto theanabolic effectof PTHon bone[J].Bone,2007,40(6):1453-1461.

[15]Wang M,Nasiri AR,Broadus AE,et al.Periosteal PTHrP regulates cortical bone remodeling during fracturehealing[J].Bone,2015,81(4):104-111.