金銳，包俊華，趙亞瓊，劉芳，唐大偉，白剛，劉麗麗，趙靜

（寧夏銀川市婦幼保健院，寧夏 銀川 750001）

隨著人類輔助生殖技術(shù)的廣泛開展和超促排卵藥物的普遍使用，卵巢的不同反應(yīng)所致的各種并發(fā)癥日益引起臨床醫(yī)師的重視，評(píng)估在超促排卵過程中的卵巢微環(huán)境對(duì)卵巢反應(yīng)性的影響[1]，了解卵巢微環(huán)境的變化，幫助臨床醫(yī)師合理使用超促排卵藥物，改善促排周期的妊娠情況。本文著重分析探討在控制性超排卵治療周期中，在使用大劑量的促排卵藥物后，不孕婦女的血清及卵泡液中金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的表達(dá)差異，分析MMP-3、VEGF及TNF與卵巢反應(yīng)性的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1　一般資料

選擇2013年3月-2015年10月在銀川市婦幼保健院生殖中心行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET） 治 療， 年 齡22～38歲，月經(jīng)規(guī)律，排卵正常，排除子宮內(nèi)膜異位癥及反復(fù)流產(chǎn)病史，且配偶精液檢驗(yàn)正常（世界衛(wèi)生組織第五版分析標(biāo)準(zhǔn)），均采用黃體期長(zhǎng)方案的413例周期不孕婦女。收集這部分患者在使用促性腺激素（Gonadotrophin，Gn）啟動(dòng)日和絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）注射日的血清標(biāo)本，并在患者取卵時(shí)收集其卵泡液。根據(jù)患者獲卵數(shù)分為3個(gè)組：獲卵數(shù)≥20個(gè)的為高反應(yīng)組，獲卵數(shù)在6～19個(gè)的為正常反應(yīng)組，獲卵數(shù)≤5個(gè)的為低反應(yīng)組。

1.2　方法

1.2.1控制性超排卵方案 采用黃體期長(zhǎng)方案。治療前1周期的黃體中期肌內(nèi)注射（肌注）長(zhǎng)效GnRHa（曲普瑞林，1.0 mg/支，德國(guó)輝凌制藥有限公司），達(dá)到垂體降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)（FSG、LH均＜5 IU/L，E2＜50 ng/L，子宮內(nèi)膜厚度＜5 mm，雙側(cè)卵巢無囊腫）后，在月經(jīng)3～5 d 時(shí)肌內(nèi)注射（肌注）Gn。經(jīng)陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡的生長(zhǎng)，待雙側(cè)卵巢中有2個(gè)卵泡平均直徑＞19 mm時(shí)，患者停止使用Gn，改為肌注hCG，將此日設(shè)定為hCG日；在使用hCG 34～36 h后患者在陰道B超的引導(dǎo)下抽取卵泡液，將卵泡液送至實(shí)驗(yàn)室并在顯微鏡下?lián)焓奥炎印?/p>

1.2.2卵子的受精及胚胎培養(yǎng)將抽吸卵泡液獲得的卵子移入濃度為6%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h，與優(yōu)化的精子結(jié)合，形成受精卵后將其移入胚胎培養(yǎng)試劑中繼續(xù)在體外培養(yǎng)3～5 d，并對(duì)形成的胚胎進(jìn)行評(píng)估打分。胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：1分：胚胎卵裂球大小如碎片一般，不一致，不對(duì)稱，無核碎片＞50%，胞漿顆粒粗糙；2分：胚胎胞漿濃縮，質(zhì)地粗糙，無核碎片占20%～50%，卵裂球大小明顯不均一；3分：胚胎胞漿飽滿，質(zhì)地略有不均，無核碎片10%～20%，卵裂球大小輕度不對(duì)稱，不一致；4分：胚胎胞漿飽滿，質(zhì)地均勻，無核碎片≤5%，卵裂球大小均一，對(duì)稱。在取卵后第3天對(duì)具有移植指針的患者選擇評(píng)分在3～4分的優(yōu)質(zhì)胚胎1～3個(gè)進(jìn)行子宮腔內(nèi)移植。

1.2.3患者的黃體支持及妊娠確認(rèn)移植術(shù)后對(duì)患者采用肌注或口服黃體酮進(jìn)行黃體支持，14 d后檢測(cè)患者血清及尿液hCG，確認(rèn)是否妊娠。14 d后患者行B超檢查，如子宮內(nèi)見妊娠囊、胎芽及胎心搏動(dòng)可確診為臨床妊娠。

患者的卵子受精及胚胎培養(yǎng)用瑞典Vitrolife 公司生產(chǎn)的G5系列培養(yǎng)液進(jìn)行。所用的培養(yǎng)皿為美國(guó)FLCON公司生產(chǎn)的型號(hào)為3037、3003及3066培養(yǎng)皿。

VEGF、TNF及MMP-3的檢測(cè)采用定量酶聯(lián)免疫法。采用雙抗體夾心酶聯(lián)米易吸附測(cè)定方法測(cè)定卵泡液和血清中的VEGF、TNF及MMP-3水平。試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。批次和批間差異＜10%。

1.2.5儀器與設(shè)備培養(yǎng)患者卵子和胚胎的培養(yǎng)箱為日本三洋CO2培養(yǎng)箱。采用美國(guó)熱點(diǎn)Thermo MK3系列酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量血清及卵泡液中的MMP-3、VEGF及TNF。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用方差分析，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，行LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　患者基本資料

共納入413例周期的患者，高反應(yīng)周期有119例，正常反應(yīng)周期有218例，低反應(yīng)周期有76例。這些患者的年齡、BMI、不孕年限組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

2.2　患者促排卵過程血清中VEGE、TNF、MMP-3的水平變化

413個(gè)周期的患者，在超促排卵過程中，隨卵泡發(fā)育，各組患者血清中MMP-3和VEGF的水平呈上升趨勢(shì)。注射hCG日血清中MMP-3和VEGF的水平與肌注Gn日比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。注射hCG日血清中MMP-3和VEGF水平高于肌注Gn日血清的MMP-3和VEGF水平。在超促排卵過程中，隨著卵泡的發(fā)育，各組患者血清中TNF水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Gn啟動(dòng)日高于肌注hCG日。見表2。

表1　患者基本資料 （±s）

表1　患者基本資料 （±s）

高反應(yīng)組（n =119）　30.34±3.80　25.14±5.10　3.78±0.31正常反應(yīng)組（n =218） 31.59±4.20　28. 42±6.33　3.87±0.29低反應(yīng)組（n =76）　34.41±4.44　29.29±6.21　4.62±0.39 F值　0.186　0.611　-0.112

2.3　患者卵巢反應(yīng)性與卵泡液中MMP-3、VEGF及TNF水平的關(guān)系

3組患者卵泡液中MMP-3、VEGF及TNF水平比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高反應(yīng)患者卵泡液中MMP-3水平高于正常反應(yīng)組和低反應(yīng)組患者。而卵泡液中VEGF和TNF的水平恰恰相反，高反應(yīng)組患者的水平低于正常反應(yīng)組和低反應(yīng)患者的水平。見表3。

①建設(shè)項(xiàng)目節(jié)水管理需要建立建設(shè)項(xiàng)目實(shí)施全過程的管理制度。一是規(guī)劃階段，發(fā)展改革主管部門組織對(duì)建設(shè)項(xiàng)目設(shè)計(jì)任務(wù)書進(jìn)行審查時(shí)，同時(shí)審查節(jié)水設(shè)施可行性情況；二是設(shè)計(jì)階段，建設(shè)單位需要提交節(jié)水評(píng)估報(bào)告，節(jié)水管理機(jī)構(gòu)需要對(duì)建設(shè)項(xiàng)目施工圖設(shè)計(jì)節(jié)水設(shè)施的情況同步審查；三是施工階段，施工單位需要按照施工圖設(shè)計(jì)文件，進(jìn)行節(jié)水設(shè)施施工；四是竣工驗(yàn)收階段，節(jié)水管理機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)節(jié)水設(shè)施進(jìn)行同步竣工驗(yàn)收，驗(yàn)收合格后通知水行政主管部門，允許建設(shè)項(xiàng)目取水或在管網(wǎng)范圍內(nèi)向建設(shè)項(xiàng)目供水；五是運(yùn)行管理階段，建設(shè)單位必須確保已經(jīng)建成節(jié)水設(shè)施的正常運(yùn)行，節(jié)水管理機(jī)構(gòu)或水行政主管部門對(duì)節(jié)水設(shè)施運(yùn)行維護(hù)情況進(jìn)行監(jiān)管、處罰。

表2　各組患者血清MMP-3、TNF、VEGF注射Gn及注射hCG日血清水平比較 （±s）

表2　各組患者血清MMP-3、TNF、VEGF注射Gn及注射hCG日血清水平比較 （±s）

MMP-3/（ng/ml）　VEGF/（mg/L）　TNF/（pg/ml）Gn日　hCG日　Gn日　hCG日　Gn日　hCG日高反應(yīng)組（n =119）　25.16±9.23　53.16±7.89　523.34±46.89　1 543.45±124.56　39.23±4.09　26.56±2.34正常反應(yīng)組（n =218）　23.34±6.14　23.47±6.24　467.23±23.56　1 324.34±107.69　42.34±6.26　30.24±3.23低反應(yīng)組（n =76）　18.19±4.26　18.29±4.19　356.24±18.79　1 108.34±109.45　47.18±3.42　32.13±4.32 F值　1.610　1.820　0.590　0.490　0.910　0.130 P值　0.006　0.004　0.002　0.019　0.040　0.002組別

表3　患者卵泡液中VEGF、TNF及MMP-3水平比較 （±s）

表3　患者卵泡液中VEGF、TNF及MMP-3水平比較 （±s）

組別　MMP-3/（ng/ml）　TNF/（pg/ml）　VEGF/（mg/L）高反應(yīng)組（n =119）　55.02±10.14　47.6±4.23　1 844.19±331.32正常反應(yīng)組（n =218）　38.89±7.23　50.7±5.45　1 608.53±328.22低反應(yīng)組（n =76）　29.19±5.03　51.99±3.25　2 270.39±234.19 F值　0.141　0.781　0.207 P值　0.011　0.000　0.010

3　討論

卵泡液是卵巢中卵子及顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境。卵泡液是由卵巢局部分泌物和血漿的滲出物共同組成的，在卵子的生長(zhǎng)、發(fā)育、排出、閉鎖中起至關(guān)重要的調(diào)控作用[2]。在IVF-ET的超促排卵過程中，在外源性促性腺激素的作用下，卵泡內(nèi)的細(xì)胞分泌不同的細(xì)胞因子形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，協(xié)同發(fā)揮生物活性功能[3]，直接或間接地影響著卵母細(xì)胞的發(fā)育、分裂、生存及以后的受精、胚胎形成及著床[4]。

MMPs家族是1個(gè)大家族，目前已分離鑒別出20個(gè)成員，編號(hào)分別為MMP 1～20，它們是一組鋅離子依賴性肽鏈內(nèi)切酶，大小各異，底物不盡相同，能裂解維系蛋白結(jié)構(gòu)的肽鏈，主要參與結(jié)締組織的降解[5]。MMPs在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育中的作用主要是可以精確調(diào)控在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育中卵巢內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分的降解和重塑，MMPs通過調(diào)節(jié)卵巢結(jié)構(gòu)成分的動(dòng)態(tài)周期性變化，對(duì)卵泡和黃體功能發(fā)揮作用。在排卵過程中，包括卵泡生長(zhǎng)和卵泡破裂釋放出成熟的卵母細(xì)胞以及顆粒細(xì)胞的黃素化，這些都涉及到廣泛的血管發(fā)生和卵巢組織重建[6]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種MMPs參與了卵泡生長(zhǎng)和排卵的過程。本研究測(cè)定分析了在控制性排卵過程中，卵巢高反應(yīng)的患者、正常反應(yīng)患者以及卵巢低反應(yīng)患者血清及卵泡液中的MMP-3的表達(dá)，可以看到血清中MMP-3的表達(dá)隨著獲卵數(shù)目地增加而有所增加，卵巢高反映的患者有較高的MMP-3水平，與此同時(shí)妊娠的患者中MMP-3的表達(dá)較未妊娠的患者高[7]，所以，血清中MMP-3可以作為預(yù)測(cè)卵巢反應(yīng)性和成功妊娠的早期指標(biāo)，從而有利于臨床早期干預(yù)。

TNF是肌肉細(xì)胞源性具有多向性作用的細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。參與細(xì)胞的增殖和凋亡等過程與慢性乙肝、自身免疫性疾病、胰島素抵抗、腫瘤等多種疾病的易感性相關(guān)[8]。TNF在卵巢上主要由顆粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，TNF參與排卵，但當(dāng)其水平較高時(shí)可抑制顆粒細(xì)胞上胰島素樣生長(zhǎng)因子1誘導(dǎo)的E2的合成和卵泡膜上LH誘導(dǎo)的雄烯二酮的合成，從而影響卵泡的發(fā)育[9]。在超排卵過程中，TNF水平隨著卵泡生長(zhǎng)成熟逐漸降低，通過抑止顆粒細(xì)胞對(duì)雌二醇及孕酮的合成對(duì)促性腺激素的反應(yīng)下降。與此同時(shí)TNF可以促進(jìn)MMP-3的活性，促使排卵發(fā)生，同時(shí)導(dǎo)致排卵后的卵泡黃素化、血管化，所以當(dāng)接近排卵時(shí)，在TNF的作用下卵泡液中的MMP-3和VEGF水平均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[10]。

VEGF在維持卵巢正常功能上起重要作用，對(duì)卵泡生長(zhǎng)、黃體分化、卵母細(xì)胞的成熟及受精是十分重要的[11]。在卵泡生長(zhǎng)的過程中，卵泡液中的VEGF誘導(dǎo)卵泡周圍的微血管形成，促進(jìn)血液中的FSH和LH更好地作用于卵母細(xì)胞，從而促進(jìn)了卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟[12]。同時(shí)卵巢中的顆粒細(xì)胞中VEGF的表達(dá)受促性腺激素和TNF等因子的調(diào)節(jié)，在卵泡期增加其通透性，促進(jìn)卵泡液聚集，利用前體物質(zhì)如脂質(zhì)的運(yùn)輸[13]，為激素的合成提供條件。在控制性超促排卵過程中，顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞分泌的VEGF促使卵泡周圍的微血管生成，從而使得卵泡有機(jī)會(huì)獲得更多的激素或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)卵泡的發(fā)育[14]。

血清中的MMP-3、TNF及VEGF等只是眾多卵巢卵泡發(fā)育微循環(huán)中的一員，對(duì)于各個(gè)因子的相互調(diào)節(jié)，互相平衡[15]，需要更進(jìn)一步地研究。分析卵泡液中的細(xì)胞因子的變化可以作為IVF-ET過程中一個(gè)輔助檢查部分，幫助臨床醫(yī)師更好地指導(dǎo)臨床用藥，改善IVF-ET中超促排卵中卵子發(fā)育的情況，提高獲得卵母細(xì)胞質(zhì)量，進(jìn)而提高IVF-ET的妊娠結(jié)局。

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