張陳彥，都治香，祁美玉，趙敏英，張銘娜，張立新，安雪麗

（1.石家莊市第一醫(yī)院產(chǎn)科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊 050000）

新生兒缺氧缺血性腦病是新生兒死亡最常見(jiàn)的原因，一些幸存者可能會(huì)遺留嚴(yán)重的長(zhǎng)期的神經(jīng)性殘疾，包括腦癱和神經(jīng)發(fā)育延遲。新生兒腦缺氧損傷的嚴(yán)重程度與受多個(gè)保護(hù)性或有害因素的相互作用結(jié)果密切相關(guān)。但導(dǎo)致這些調(diào)控因素的原理機(jī)制還不完全明白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究已證實(shí)，缺氧缺血可造成神經(jīng)元死亡。對(duì)缺血缺氧的干預(yù)，可減少缺氧缺血后的腦損傷。圍產(chǎn)期的缺血缺氧對(duì)新生兒腦損傷的預(yù)后有至關(guān)重要的影響［1］。但治療胎兒缺氧導(dǎo)致的新生兒大腦缺氧缺血性腦病仍然遙遙無(wú)期。本研究的目的是制備宮內(nèi)窘迫胎鼠模型調(diào)查三磷酸腺苷二鈉氯化鎂對(duì)缺血缺氧性腦損傷腦細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的分組和建立 取同批成年雌性Sprague-Dawley大鼠15只，孕鼠隨機(jī)分為缺血缺氧再灌注組（I／R組）和假手術(shù)（Sham組）、三磷酸腺苷二鈉氯化鎂治療組（T／M組）三組，每組各5只。于妊娠第19天以3.5%水合氯醛（1 mL／100 g）腹腔注射麻醉，通過(guò)無(wú)損傷動(dòng)脈鉗鉗夾雙側(cè)子宮、卵巢血管20 min建立缺血缺氧宮內(nèi)窘迫模型。T／M組缺血前30 min，45 mg·kg-1三磷酸腺苷二鈉氯化鎂腹腔注射，Sham組和I／R組于相同時(shí)間給予同等體積的0.9%氯化鈉注射液。Sham組只進(jìn)行開(kāi)關(guān)腹手術(shù)，不鉗夾子宮卵巢動(dòng)脈。各組孕鼠缺氧20 min后拆除動(dòng)脈夾以恢復(fù)血供，并逐層關(guān)腹。各組均于手術(shù)后24 h取標(biāo)本。

1.2 方法 各組均于關(guān)腹后24 h剖宮取胎，先確定胎鼠是否存活，點(diǎn)清死胎數(shù)，在每組存活胎鼠中隨機(jī)抽取10只斷頭取腦，剝離頭皮，沿前囟剪開(kāi)顱骨，取全腦標(biāo)本。于視交叉起始向尾側(cè)，冠狀切面厚2mm，標(biāo)本置于4%多聚甲醛浸泡24 h經(jīng)乙醇脫水后用石蠟浸泡并制成蠟塊。據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，取丘腦中1／3平面，水平冠狀切片厚5μm，制成石蠟切片。

1.3 指標(biāo)檢測(cè) 于術(shù)后24 h以3.5%水合氯醛對(duì)孕鼠行腹腔麻醉，開(kāi)腹并暴露雙側(cè)子宮，觀察宮腔內(nèi)的活胎數(shù)，剖出胎鼠并觀察存活新生鼠皮膚顏色、四肢運(yùn)動(dòng)等情況。計(jì)算胎鼠死亡率。取胎鼠，斷頭處死，取出完整胎腦，于4%多聚甲醛固定48 h，經(jīng)脫水透明后石蠟包埋切片，備用。

取胎鼠腦組織，濾紙拭干，稱質(zhì)量后，加入4℃的HEPES緩沖液中，其體積是腦組織塊質(zhì)量的9倍，用玻璃勻漿器制成勻漿，勻漿液以3 000 r·min-1離心15 min，分裝于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用分光光度計(jì)檢測(cè)胎鼠腦組織的丙二醛（MDA）水平。MDA試劑盒，購(gòu)于南京建成科技有限公司。

固定后的組織分置于40 g·L-1多聚甲醛中4℃后固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片，脫蠟，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較為單因素方差分析＋LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率表示，比較采用整體＋分割χ2檢驗(yàn)。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胎鼠死亡率 I／R組胎鼠死亡率23.31%，明顯高于 Sham組（p＜0.05），T／M組胎鼠死亡率15%，較I／R組顯著降低（p＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組胎鼠死亡率

2.2 胎鼠腦組織MDA表達(dá) 與Sham組比較，I／R組胎鼠腦組織MDA含量顯著增高（p＜0.05），但T／M組胎鼠腦組織MDA活性顯著降低（p＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組胎鼠心組織中MDA的變化

2.3 腦組織HE染色病理學(xué)變化 光鏡下Sham組細(xì)胞層次清晰，腦細(xì)胞完整，細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯損傷性改變（見(jiàn)圖1）。T／M組細(xì)胞排列紊亂，組織疏松水腫，神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞變性（見(jiàn)圖2）。I／R組可見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次紊亂加重，細(xì)胞水腫組織疏松水腫更加嚴(yán)重，細(xì)胞皺縮，核濃縮，胞質(zhì)內(nèi)核碎片，尚可見(jiàn)單個(gè)圓形凋亡小體，還有部分壞死病灶，周圍可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖3）。

圖1 Sham組病理圖（HE×10）

圖2 T／M組病理圖（HE×10）

圖3 I／R組病理圖（HE×10）

3 討論

妊娠期缺氧是影響胎兒發(fā)育和增加新生兒發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的常見(jiàn)原因。圍產(chǎn)期新生兒腦損傷是缺氧缺血性腦病最常見(jiàn)的原因［2］。缺氧缺血性損傷影響胎兒或新生兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育［3］。雖說(shuō)缺氧缺血性腦病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但近年來(lái)的研究表明，不良宮內(nèi)環(huán)境可能造成腦發(fā)育異常［4］。缺氧是宮內(nèi)創(chuàng)傷中一種常見(jiàn)形式，和胎兒在經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間各種可能缺氧的條件密切相關(guān)，包括在高海拔地區(qū)懷孕、妊娠合并貧血、胎盤(pán)功能不全、脊髓壓迫、先兆子癇、合并心臟、肺和腎臟疾病、或血紅蛋白病等。研究表明，胎兒缺氧影響新生兒正常的大腦發(fā)育和導(dǎo)致各種的神經(jīng)功能缺損［5］。

新生兒缺血缺氧性腦病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，一般認(rèn)為，腦能量代謝障礙、氧自由基損害、鈣離子失衡及興奮性氨基酸毒性作用是引起缺血細(xì)胞死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。三磷酸胞苷二鈉是一類腺苷酸藥物，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的核酸、磷脂及蛋白質(zhì)等成分的合成及代謝有促進(jìn)作用，能調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生物膜合成，使神經(jīng)細(xì)胞的抗損傷能力增強(qiáng)，還可營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，使神經(jīng)細(xì)胞的凋亡速度得以延緩［6］。鎂，稱為“高能離子”是細(xì)胞內(nèi)第二個(gè)最豐富的陽(yáng)離子，超過(guò)300種酶的輔因子，其中一些催化氧化磷酸化，激活能量?jī)?chǔ)存和代謝ATP。此外，鎂離子參與細(xì)胞膜的調(diào)節(jié)滲透性和動(dòng)脈壓?？赡芤蚣?xì)胞內(nèi)ATP和ADP存在鎂復(fù)合物和ATP酶需要鎂作為輔因子，氯化鎂能增強(qiáng)三磷酸腺苷的作用。

各種不利的循環(huán)條件下如低血容量休克、局部缺血和敗血癥等各種損傷中，給予外源性的三磷酸腺苷二鈉氯化鎂能夠改善亞細(xì)胞、細(xì)胞或器官的功能，糾正或改善動(dòng)物休克后的生存率［7］。三磷酸腺苷二鈉氯化鎂能夠提高第二信使cAMP和IP3的基礎(chǔ)水平，在出血性休克時(shí)降低其在膜信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的損傷。因此，發(fā)生失血性休克時(shí)經(jīng)三磷酸腺苷二鈉氯化鎂處理對(duì)細(xì)胞膜功能的有有利影響［8］。在缺血缺氧的狀態(tài)下，心血管系統(tǒng)會(huì)改變心率，心輸出量重新分配，以保護(hù)有限的能源資源，保持大腦足夠的能量供給［9］。且三磷酸腺苷二鈉氯化鎂對(duì)脊髓損傷有保護(hù)作用［10］。鎂離子還可促進(jìn)氧與產(chǎn)婦和胎兒血紅蛋白的結(jié)合，提高子宮胎盤(pán)的血流速度，從而提高產(chǎn)婦與胎兒之間的物質(zhì)交換，提高胎盤(pán)的功能［11］。ATP對(duì)缺血缺氧損傷的保護(hù)作用機(jī)制是三磷酸腺苷二鈉氯化鎂可以直接提供對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈉離子的能量或能量底物-鉀-ATP酶以及鈣-ATP酶保留在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，減輕細(xì)胞內(nèi)酸中毒和細(xì)胞腫脹。此外，三磷酸腺苷氯化鎂也對(duì)微循環(huán)的改善效果，修復(fù)膜的電壓，恢復(fù)正常膜的滲透性和細(xì)胞功能的改進(jìn)［12］。氯化鎂的二價(jià)陽(yáng)離子抑制ATP的螯合作用，并且抑制ATP的脫氨基作用和去磷酸化，從而維持組織的高ATP水平。圍產(chǎn)期腦損傷后細(xì)胞凋亡較顯著。由于三磷酸腺苷二鈉氯化鎂的神經(jīng)保護(hù)作用，可以降低新生兒缺氧缺血腦病的風(fēng)險(xiǎn)。

本實(shí)驗(yàn)中 I／R組胎鼠死亡率明顯高于Sham組，T／M組胎鼠死亡率較缺血缺氧組顯著降低，從而證實(shí)三磷酸腺苷二鈉氯化鎂可以降低宮內(nèi)窘迫胎鼠死亡率，提高存活率。本研究病理組織學(xué)結(jié)果提示，光鏡下Sham組細(xì)胞層次清晰，腦細(xì)胞完整，細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯損傷性改變。無(wú)水腫，無(wú)核濃縮，無(wú)核碎片，凋亡小體少見(jiàn)，并且未見(jiàn)壞死灶。I／R組可見(jiàn)細(xì)胞水腫，細(xì)胞皺縮，核濃縮，胞質(zhì)內(nèi)核碎片，尚可見(jiàn)單個(gè)圓形凋亡小體，還有部分壞死病灶，周圍可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；T／M組上述現(xiàn)象明顯減少、減輕。提示三磷酸腺苷二鈉氯化鎂在減輕宮內(nèi)窘迫胎鼠腦組織損傷方面有明顯的保護(hù)作用。

三磷酸腺苷二鈉氯化鎂降低缺血再灌注過(guò)氧化產(chǎn)物，從而減弱線粒體的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，達(dá)到清除氧自由基的功能［9］。而組織中MDA水平可用于測(cè)定組織中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，是反映自由基損傷程度的重要指標(biāo)［13］。本組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，與Sham組比較，I／R組胎鼠腦組織MDA含量顯著增高，但T／M組胎鼠腦組織MDA活性顯著降低，提示三磷酸腺苷二鈉氯化鎂能夠減少M(fèi)DA生成，從而減輕組織的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，減輕宮內(nèi)窘迫胎鼠腦損傷方面有明顯的保護(hù)作用。此理論提示三磷酸腺苷二鈉氯化鎂可以是治療新生兒缺氧缺血性腦病的選擇。這種療法應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)的臨床療效研究論證。

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