崔娟

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南南陽473000）

斯氏法離體蛙心灌注實驗普遍用于人體生理學(xué)、病理生理學(xué)、藥理學(xué)、運動生理學(xué)等實驗教學(xué)中，是醫(yī)學(xué)機能實驗中常用的觀察心臟活動的方法[1]。因離體蛙心不受神經(jīng)、體液干擾，而在蛙靜脈竇作用下自主興奮，仍繼續(xù)工作，故也是各研究單位觀察藥物、食物對心臟影響的重要方法。該實驗成功與否容易受到諸多人為因素如蛙心臟血管分離結(jié)扎、蛙心套管液面保持等影響[2]。筆者發(fā)現(xiàn)，任氏液灌注時間長短對離體蟾蜍心臟功能的影響也頗為重要，但文獻報道較少，為此我們進行了粗淺研究，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物中華蟾蜍50只，雌、雄兼有，體重（90．3±10．5）g，體長（10．6±1．4）cm，精神良好，由南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實驗動物中心提供。

1.1.2藥品任氏液由機能實驗室按標(biāo)準(zhǔn)配方[3]自行配置：NaCl 6．50 g，KCl 0．14 g，CaCl20．12 g，NaHCO30．20 g，NaH2PO40．01 g，葡萄糖1．0 g，加雙蒸水至1 000 ml配制而成，所用試劑均為化學(xué)純級試劑。

1.1.3儀器與試劑儀器：蛙類通用手術(shù)器械，刻度蛙心套管，雙凹夾，鐵支架，蛙心夾，肌張力換能器和BL－420型生物機能實驗系統(tǒng)（四川成都泰盟科技有限公司），電子天平（上海醫(yī)用激光儀器廠），貝克曼庫爾特AU680型全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。試劑：肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2　方法

1.2.1離體蟾蜍心臟標(biāo)本制備采用斯氏法蛙心插管[4]：取蟾蜍1只，用探針破壞腦和脊髓，仰臥位固定于蛙板上，充分暴露心臟，在左主動脈下穿一根線，距動脈圓錐2～3 mm處結(jié)扎，再從左、右兩主動脈下方穿一根線，打一活結(jié)留作固定插管用。用眼科剪在動脈圓錐前端處向心臟方向剪一斜口，將盛有任氏液的蛙心插管由此口插入心室腔內(nèi)，提起套管，連同近旁血管一起結(jié)扎固定，在結(jié)扎線遠(yuǎn)心端剪斷周圍組織，將心臟離體，隨即用任氏液反復(fù)沖洗心室內(nèi)余血，直至插管內(nèi)灌流液完全澄清，然后保持套管內(nèi)的液面高度約2．5 cm，畫線標(biāo)記，用雙凹夾將蛙心套管固定于鐵支架上備用。

1.2.2實驗方法心肌收縮情況觀察：用蛙心夾夾住心尖，另一端穿線，與肌張力換能器相連，換能器與BL－420型生物機能實驗系統(tǒng)的通道1連接。心肌酶測定：觀察心肌收縮情況后，立即剪取心尖部心肌組織用4℃蒸餾水反復(fù)沖洗，經(jīng)濾紙吸干后稱重，制成10%的心肌組織勻漿，4℃，3 500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液于－80℃的冰箱中保存[5]，500倍稀釋液采用貝克曼庫爾特AU680型全自動生化分析儀測定LDH和CK的含量。

1.2.3分組方法將50只中華蟾蜍隨機分為5組（A組、B組、C組、D組、E組），每組10只。蟾蜍心臟離體后，連通BL－420型生物機能實驗系統(tǒng)，待心臟搏動穩(wěn)定后，開始計時，截取0分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘及60分鐘時的收縮曲線，分別作為A組、B組、C組、D組及E組的心率、心肌收縮力的分析依據(jù)。

1.3　統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　任氏液灌注時間對離體蟾蜍心臟的心率、心肌收縮力、CK和LDH含量的影響（見表1）

由表1可以看出，任氏液灌注的不同時間，各組心率、心肌收縮力、CK和LDH含量比較，存在顯著性差異（P＜0．01）。

表1　任氏液灌注時間對離體蟾蜍心臟的心率、心肌收縮力、CK和LDH含量的影響（±s）

表1　任氏液灌注時間對離體蟾蜍心臟的心率、心肌收縮力、CK和LDH含量的影響（±s）

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2.2　任氏液灌注不同時間不同觀察指標(biāo)兩兩比較的結(jié)果（見表2）

由表2可以看出，離體蟾蜍心臟用任氏液灌注0分鐘、15分鐘、30分鐘時，其心率、心肌收縮力、CK和LDH含量比較，無顯著性差異（P＞0．05）。而45分鐘時，其各項指標(biāo)與30分鐘時相比，存在顯著性差異（P＜0．05），顯示已有心力衰竭跡象。60分鐘時，心肌細(xì)胞內(nèi)CK和LDH含量明顯減少，故心率顯著減慢，心肌收縮力嚴(yán)重降低，與45分鐘時相比，存在顯著性差異（P＜0．01），顯示心力衰竭已經(jīng)發(fā)生。故而離體蟾蜍心臟實驗的觀察一般應(yīng)于30分鐘內(nèi)完成，最長不能超過45分鐘，此結(jié)論與安紅梅等[6]的研究有相似之處。超過45分鐘，蟾蜍心臟已有心力衰竭的現(xiàn)象，對各種實驗指標(biāo)的觀察皆有嚴(yán)重干擾。

3　討論

心臟是血液循環(huán)的動力器官，離體蟾蜍心臟排除神經(jīng)、體液因素對心功能的影響，可以從質(zhì)和量上保證研究的準(zhǔn)確性、科學(xué)性。為維持離體蟾蜍心臟正常營養(yǎng)及電解質(zhì)供給而灌注任氏液，但灌注時間過長勢必對離體蟾蜍心臟的心功能產(chǎn)生不利影響。肌酸激酶又稱肌酸磷酸激酶，是參與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運、肌肉收縮、ATP再生的重要激酶，在骨骼肌、心肌中含量較多。乳酸脫氫酶是糖代謝產(chǎn)生能量過程中的重要糖酵解酶，心肌、骨骼肌和腎臟中含量最豐富。盡管蟾蜍心臟沒有冠狀動脈，耐缺氧能力較強，但心肌缺血缺氧時間過長也會導(dǎo)致能量代謝障礙，心肌不可逆損傷，心肌細(xì)胞內(nèi)酶如CK和LDH外漏，致使心率減慢、心肌收縮力降低，誘發(fā)心力衰竭，因此，心肌細(xì)胞損傷程度可以通過測定心肌細(xì)胞內(nèi)CK和LDH含量來衡量[7]。故本研究中任氏液灌注時間超過45分鐘時，各項指標(biāo)如心率、心肌收縮力、CK和LDH含量嚴(yán)重下降，此失真現(xiàn)象將會影響在離體蟾蜍心臟上各種研究的科學(xué)性、準(zhǔn)確性。為提高離體蟾蜍心臟實驗成功率，縮短離體時間，應(yīng)注意以下幾點：在開展觀察前：（1）要熟悉蟾蜍心臟的解剖結(jié)構(gòu)；（2）熟練掌握蟾蜍心臟離體手術(shù)步驟；（3）熟練掌握蛙心套管插入的方法和技巧；（4）能準(zhǔn)確判定蛙心套管插入是否成功；（5）正確維護離體蟾蜍心臟。

綜上所述，離體蟾蜍心臟灌注實驗因其簡單方便，直觀性強，不受機體神經(jīng)、體液等干擾，成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的重要方法，但蟾蜍心臟離體時間過長，將會對觀察產(chǎn)生不利干擾。

表2　任氏液灌注不同時間不同觀察指標(biāo)兩兩比較的結(jié)果

參考文獻：

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[5]劉兵波，彭新，邱春復(fù)，等．不同糖濃度K－H液對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的影響[J]．贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，29（2）：170－172．

[6]安紅梅，紅日木沙，鄭倩，等．不同濃度沒食子兒茶素沒食子酸酯對離體蟾蜍心臟功能的影響[J]．四川生理科學(xué)雜志，2017，39（1）：11－12．

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