方安寧，嚴家來，周衛(wèi)鳳，黃玲，丁艷

（1.安徽醫(yī)學高等?？茖W校，安徽合肥230601；2.南京市第二醫(yī)院，江蘇南京210003）

1　miRNAs的產(chǎn)生及其在肝組織中的表達

成熟的miRNAs是一類長約21～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，編碼miRNAs的基因在細胞核中經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ加工生成一種長度約為70 nt的初始轉(zhuǎn)錄本pri-miRNAs。該轉(zhuǎn)錄本在RNA酶Dorsha的作用下加工成miRNA前體pre-miRNA。Exportin 5蛋白能與pre-miRNA特異性結(jié)合并將其輸出細胞核進入細胞質(zhì)。進入細胞質(zhì)的pre-miRNA在Dicer酶的作用下進一步被剪切成為一個不穩(wěn)定的dsRNA分子，接著在解旋酶的作用下生成成熟的單鏈miRNA，通過與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)（UTR）和編碼區(qū)域的堿基互補配對抑制靶mRNA翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因表達[2]。miRNAs的功能非常重要，包括參與早期發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞死亡、脂肪代謝和細胞分化，目前認為體內(nèi)至少30%的基因表達受miRNAs調(diào)控[3]。

既往對miRNAs的研究主要集中于它們在細胞內(nèi)的活動，目前已有一些文獻報道了在肝癌中表達失調(diào)的miRNAs[4-15]，隨著miRNAs功能研究的不斷深入，miRNAs在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用也逐漸被研究者所關(guān)注。自2005年Murakami等首次報道m(xù)iRNAs在正常肝臟和肝癌中的表達差異以來，已有多篇文獻報道了肝癌中異常表達的miRNAs[4-15]。在肝癌中表達上調(diào)的miRNAs有：miR-122、miR-21、miR-199a/b-3p、miR-223等，在正常肝臟中僅有9個miRNAs處于高豐度表達，占整個肝臟的miRNAs組的88.2%。其中表達最高的是miRNAs-122，第三高的miRNAs199a/b-3p的低表達與生存期顯著相關(guān)。在HCC中表達下調(diào)的miRNAs有Let-7a、miR-101、miR-122、miR-125a、miR-139a、miR-143、miR-195、miR-26和miR-29等。由HsuPW[16]預(yù)測人類miRNAs在病毒基因中作用位點的一個軟件（http：vita.mbe.nctu.edu.tw），Let-7a是HBV基因組的保守序列中的一個潛在的作用位點。另有文獻[17-18]報道組織中miR-17-5p在肝癌轉(zhuǎn)移中升高，可以作為預(yù)后標志物。miRNAs在肝相關(guān)疾病組織中的研究比較熱門，但無法確定哪一個或哪幾個miRNA的表達失調(diào)在HCC發(fā)展中發(fā)揮核心作用，但是我們還是可以看出一些在肝癌診斷方面達成共識的miRNAs，像miR-122a、miR199[19]等，在肝癌中不同miRNAs的表達所影響的信號通路（見圖1）[4]可以很直觀地發(fā)現(xiàn)受體絡(luò)氨酸激酶（這里表示肝細胞生長因子HGF/蛋氨酸原癌基因MET唯一軸），RAS和P13K途徑被下調(diào)的miR-199a/b-3p，Let-7和上調(diào)的miR-21所影響，導致細胞的癌變。miR-199a/b-3p、Let-7、miR-21這3種miRNA在病毒肝炎、肝硬化及肝細胞性癌患者的外周循環(huán)中也比較有意義，是否可以作為腫瘤標志物尚不可知。在HCC腫瘤發(fā)生過程中各種miRNAs所起的作用，其中miR-21、miR-199、miR-221、miR-122、miR-101和Let-7同樣起重要作用，見圖2[12]。

圖1　肝癌中不同miRNAs的表達的信號通路示意圖

圖2　miR－21、miR－199、miR－221、miR－122、miR－101和Let－7在HCC發(fā)生中的作用

2　血清循環(huán)miRNA與疾病的診斷

半個多世紀前，Mandel和Metais在血漿和血清中發(fā)現(xiàn)了循環(huán)核酸（CNAs）[20]。隨著不斷改進檢測技術(shù)和方法，循環(huán)核酸在臨床疾病診斷中的應(yīng)用得到了較大進步，在很多領(lǐng)域取得了巨大成就，如器官移植、遺傳性疾病的產(chǎn)前檢查等[21]。早期的研究也表明，在腫瘤患者的血漿中，RNA的量顯著增加，腫瘤細胞的基因表達譜也和正常細胞有顯著差異[22-23]。近年來發(fā)現(xiàn)的miRNA也和腫瘤等各種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。由于病變組織細胞中的miRNA表達往往失調(diào)，且miRNA在血漿中極其穩(wěn)定，研究者推測miRNA可以作為一種理想的以血液檢測為基礎(chǔ)的生物標志。

Chen等[24]通過對健康中國人的血清進行Solexa測序，鑒定了男性和女性血清中的miRNA數(shù)目分別為100和91。Taylor等[25]對同一卵巢癌患者的細胞和外核體研究發(fā)現(xiàn)，在467條miRNA中有218條呈現(xiàn)陽性。Mitchell等[26]通過分離健康人血漿中的18～24個核苷酸的RNA，得到37種左右miRNAs，包括Let-7a、miR-16、miR-15b等。對3份獨立的健康人血漿miR-16、miR-24（血漿中中等豐度表達）和miR-15b（血漿中低等豐度表達）進行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)這3種miRNAs的濃度為8 910～133 970拷貝/微升。同時，他們將人的前列腺癌細胞22Rvl導入NOD/SCID免疫缺陷小鼠中，發(fā)現(xiàn)能在小鼠血漿中檢測到原本不存在的miR-629*和miR-660，而且miRNAs的豐度與腫瘤的大小相關(guān)，并可作為診斷腫瘤的生物標志物。

3　循環(huán)中miRNAs與肝相關(guān)疾病診療的關(guān)系

循環(huán)中miRNAs可作為疾病的“指紋”去預(yù)測生存狀態(tài)[27-30]。大多數(shù)人認為循環(huán)RNA來自細胞凋亡或壞死、細胞主動釋放以及循環(huán)細胞的分裂。有些核酸蛋白1（NPM1）能夠介導部分miRNAs由胞內(nèi)釋放到胞外并且保護它在胞外不被核酸酶降解，有些循環(huán)miRNA由多種未知的成分構(gòu)成。由于它們含量豐富且具有組織的特異性、循環(huán)中的相對穩(wěn)定性，循環(huán)中miRNAs作為獨特的、易獲得的分子標志物來檢測和監(jiān)控癌癥具有深遠的影響。循環(huán)中的miRNAs能夠反映組織的一些信號，像丙型肝炎患者血清miR-122表達比正常人高，且和ALT表達有非常高的一致性[31]，而且還與病毒載量、乙肝表面抗原量、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）等相關(guān)[32]。有學者報道m(xù)iR-500在外周血中的表達隨肝癌術(shù)前術(shù)后發(fā)生變化，但只觀察了3例[33]。最新研究表明，miR-101可能是HBV相關(guān)肝癌診斷及進展監(jiān)控的潛在標志物[34-35]。

循環(huán)miRNAs在肝癌中表達失調(diào)的報道比較少[36]，具體哪些miRNA在診斷中起主要作用目前還存在很多爭論，距離在臨床診斷中應(yīng)用還有待進一步驗證。本課題擬進行如下3個方面工作：（1）以乙型及丙型肝炎單獨和重疊感染、肝硬化和肝細胞癌患者血清為參考樣本，通過exqion的LNATMmiRNA芯片對健康對照、肝硬化及肝癌患者血清中潛在的循環(huán)miRNAs進行初步分析與對比，篩選可能與肝病相關(guān)的miRNAs；（2）通過臨床病例對照研究，用莖環(huán)法實時熒光定量PCR對幾種可能與肝病相關(guān)的循環(huán)miRNAs進行初步驗證，以此初步探索循環(huán)miRNAs作為肝臟相關(guān)疾病分子標志物的可能性，再聯(lián)合AFP、AFP-L3及GP73做相關(guān)性研究及通過受試者工作特征曲線（ROC曲線）來評價實驗的特異性和準確性；（3）利用生物信息學并結(jié)合有關(guān)文獻，對優(yōu)勢的miRNAs潛在靶基因進行預(yù)測并探討肝病患者血清中的miRNAs可能原因。期待能發(fā)現(xiàn)特異性較強的miRNAs生物標志物，為早期診斷或鑒別診斷肝癌及為肝相關(guān)疾病的miRNAs靶向治療提供依據(jù)。

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