王瑩　康曉靜　趙娟　梁俊琴　張德志　柴莉　王鵬　王唯嘉

830001烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科

研究表明，啟動(dòng)子甲基化可通過(guò)滅活腫瘤抑制基因?qū)е聬盒阅[瘤發(fā)生，而甲基化轉(zhuǎn)移酶可通過(guò)沉默腫瘤抑制基因使胞嘧啶發(fā)生甲基化而致病。5-羥甲基胞嘧啶（5?hmc）是5甲基胞嘧啶（5?mc）發(fā)生異常甲基化形成的一種重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，參與多種生理及病理過(guò)程［1］。我們通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)5?hmc在黑素瘤中的表達(dá)，探討5?hmc表達(dá)與黑素瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系，分析其臨床意義。

圖1　免疫組化檢測(cè)5-羥甲基胞嘧啶（5?hmc）表達(dá)（×100） 1A：黑素瘤組織表達(dá)5?hmc；1B：色素痣組織高表達(dá)5?hmc

表1　黑素瘤中5-羥甲基胞嘧啶表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

一、材料及方法

1.標(biāo)本來(lái)源及臨床病理特征：選取新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院病理科及皮膚科2004年1月至2015年12月病理確診為黑素瘤的石蠟包埋組織67份及色素痣石蠟包埋組織20份。67例黑素瘤患者均無(wú)家族史，發(fā)病年齡28～95（62.01±13.28）歲，其中20～40歲5例，41～50歲11例，51～60歲15例，61～70歲16例，71～95歲20例。維吾爾族36例（53.73%），漢族31例（46.27%）。男性37例（55.22%），女性30例（44.78%）。病程1個(gè)月至22年，中位病程31個(gè)月。18例（26.87%）發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，49例（73.13%）無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）臨床分期基于病理對(duì)原發(fā)病灶的評(píng)估，將初診患者分為以下3期：Ⅱ期20例（29.85%），無(wú)區(qū)域及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅲ期6例（8.96%），有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅳ期41例（61.20%），有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Clark分級(jí)Ⅰ～Ⅲ級(jí)26例（38.81%），Ⅳ、Ⅴ級(jí)41例（61.19%）。67例患者中45例接受手術(shù)治療（包括局部腫瘤切除、截指/趾及擴(kuò)大切除），22例因年齡等因素未接受手術(shù)治療。

2.主要試劑：一抗為兔抗人多克隆5?hmc特異性抗體，來(lái)自美國(guó)Active Motif公司，濃度為1∶500。鼠抗兔通用型二抗、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

3.免疫組化SP法檢測(cè)5?hmc的表達(dá)：將4%甲醛固定、石蠟包埋的黑素瘤或痣組織切片，常規(guī)烤片、脫蠟、水化；浸入0.01 mmol/L pH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液內(nèi)，熱抗原修復(fù)3 min；3%H2O2室溫孵育30 min；DAB顯色1 min左右；自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，通透、脫水，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對(duì)照。

4.結(jié)果判斷：5?hmc陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞核。觀察全片，借助高分辨顯微鏡隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)100倍視野，得出陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。采用半定量積分法，對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞率及陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)計(jì)分。染色強(qiáng)度分為3級(jí)：無(wú)著色0分，淺著色1分，棕黃色2分；按陽(yáng)性細(xì)胞的百分比分為4級(jí)：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。每張切片最后的得分即5?hmc表達(dá)水平為染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比分級(jí)的乘積，≥3分是高表達(dá)，＜3分是低表達(dá)。

5.隨訪(fǎng)：對(duì)入選本研究的67例黑素瘤患者進(jìn)行電話(huà)隨訪(fǎng)，生存期的計(jì)算自患者接受手術(shù)之日起至死亡或2016年12月31日末次隨訪(fǎng)日，至末次隨訪(fǎng)日仍存活者生存時(shí)間定為刪失值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用卡方檢驗(yàn)比較5?hmc在黑素瘤和色素痣組織中的表達(dá)率，并分析黑素瘤患者5?hmc表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系；計(jì)算不同組的生存率，應(yīng)用Kaplan?Meier法繪制累計(jì)生存率曲線(xiàn)；利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素回歸分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.5?hmc在黑素瘤及色素痣中的表達(dá)：見(jiàn)圖1。67例黑素瘤中，27例表達(dá)5?hmc，表達(dá)率為40.30%；42例（62.69%）為低表達(dá)，25例（37.31%）為高表達(dá)。20例色素痣組織中，15例表達(dá)5?hmc，表達(dá)率為75%。5?hmc在黑素瘤組中的表達(dá)率明顯低于色素痣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.428，P=0.006）。

2.黑素瘤中5?hmc表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系：臨床分期較晚期黑素瘤組織中5?hmc表達(dá)水平明顯低于早期黑素瘤組織（χ2=4.416，P=0.036）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者表達(dá)水平明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（χ2=5.902，P=0.015），且5?hmc表達(dá)水平隨黑素瘤組織Clark分級(jí)升高及浸潤(rùn)深度加深而降低（χ2=4.828，P=0.028）。5?hmc表達(dá)水平在不同年齡、性別、民族黑素瘤患者之間分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3.黑素瘤患者生存情況：67例患者均獲得完整隨訪(fǎng)記錄，隨訪(fǎng)時(shí)間［M（P25～P75）］為36（12～47）個(gè)月，隨訪(fǎng)期間死亡 14例，存活時(shí)間［M（P25～P75）］為32（11～ 38）個(gè)月。采用壽命表法計(jì)算1年、3年、5年生存率分別為79%、47%、32%，標(biāo)準(zhǔn)誤分別為0.008、0.010、0.011。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未行手術(shù)切除、5?hmc低水平表達(dá)、Clark分級(jí)較高、臨床分期較晚患者生存期明顯縮短。見(jiàn)圖2。

4.COX回歸分析結(jié)果：?jiǎn)我蛩鼗貧w分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級(jí)、臨床分期、5?hmc表達(dá)水平與黑素瘤預(yù)后相關(guān)，年齡、性別、民族與預(yù)后無(wú)關(guān)，見(jiàn)表2。將單因素分析中與預(yù)后不良有關(guān)指標(biāo)納入模型進(jìn)行多因素Cox回歸模型分析，結(jié)果顯示，遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.01）、未手術(shù)切除（P=0.04）、5?hmc低水平表達(dá)（P=0.03）、Clark分級(jí)（P=0.03）、AJCC分期（P＜0.01）為預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素，見(jiàn)表2。

三、討論

5?hmc是5?mc經(jīng)DNA羥化酶家族成員TET（ten?eleven translocation）催化發(fā)生去甲基化生成。5?hmc作為DNA去甲基化的重要中間產(chǎn)物，僅存在于哺乳動(dòng)物中［2?3］，在一系列惡性腫瘤中存在缺失表達(dá)［4?5］，提示5?hmc缺失是細(xì)胞分化和腫瘤進(jìn)展過(guò)程中重要的表觀遺傳學(xué)事件之一。對(duì)黑素瘤及其他惡性腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，TET家族酶表達(dá)減少可導(dǎo)致5?hmc缺失表達(dá)［5?6］。Lian等［7］運(yùn)用DNA羥甲基化免疫共沉淀?芯片檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)全基因組DNA羥甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在黑素瘤患者全基因組中，無(wú)論啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子還是基因間結(jié)構(gòu)均存在5?hmc低表達(dá)。

研究顯示，黑素瘤患者存在大量基因位點(diǎn)的低甲基化以及特定基因和抑癌基因的高甲基化［8?9］，多基因位點(diǎn)的DNA異常甲基化可能作為黑素瘤與色素痣的診斷鑒別要點(diǎn)［9?10］。但目前仍未發(fā)現(xiàn)特征性的表觀遺傳修飾可作為分子學(xué)標(biāo)記應(yīng)用于黑素瘤惡性程度的診斷與評(píng)價(jià)。有學(xué)者通過(guò)建立動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)提高5?hmc表達(dá)可抑制黑素瘤生長(zhǎng)并提高無(wú)瘤生存率，同時(shí)5?hmc在黑素瘤及色素痣中存在差異表達(dá)，提示5?hmc對(duì)黑素瘤可能具有一定診斷價(jià)值［7?8］。近來(lái)研究也證實(shí)，5?hmc對(duì)于黑素瘤診斷具有一定意義［11?13］。

我們采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)5?hmc在黑素瘤中的表達(dá)，結(jié)果顯示，黑素瘤5?hmc表達(dá)陽(yáng)性率為40.30%，明顯低于色素痣（75%）。而且隨著腫瘤浸潤(rùn)程度加深及臨床進(jìn)展，5?hmc表達(dá)水平逐漸下降。5?hmc總體表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級(jí)、AJCC分期、總體生存率有明顯的相關(guān)性。本文結(jié)論與Lian等［7］和Uchiyama等［10］研究結(jié)果一致。

圖2　黑素瘤獨(dú)立預(yù)后因素相關(guān)生存曲線(xiàn)　2A：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)生存曲線(xiàn)；2B：5-羥甲基胞嘧啶（5?hmc）表達(dá)相關(guān)生存曲線(xiàn)；2C：手術(shù)切除相關(guān)生存曲線(xiàn)；2D：Clark分級(jí)相關(guān)生存曲線(xiàn)；2E：AJCC分期相關(guān)生存曲線(xiàn)

表2　影響黑素瘤生存時(shí)間的單因素及多因素分析結(jié)果

我們運(yùn)用單因素Cox回歸模型分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級(jí)、AJCC分期、5?hmc表達(dá)水平與黑素瘤預(yù)后相關(guān)，多因素分析顯示患者存在遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未手術(shù)切除、5?hmc低水平表達(dá)、Clark分級(jí)、AJCC分期與黑素瘤預(yù)后有關(guān)，與本課題組前期分析結(jié)果一致［14?15］。本研究中，臨床分期較早并行手術(shù)切除的患者預(yù)后相對(duì)較好，而早期發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者臨床分期較晚，不宜行手術(shù)切除，輔以放化療及免疫靶向治療，預(yù)后相對(duì)不佳，提示臨床對(duì)黑素瘤早期診斷及行預(yù)后評(píng)估對(duì)延長(zhǎng)患者生存率有一定意義。5?hmc在黑素瘤不同臨床分期中表達(dá)水平有明顯差異，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期較晚、未行手術(shù)切除的患者中表達(dá)水平降低，臨床分期越晚，其水平越低，提示5?hmc可能作為臨床黑素瘤早期診斷及預(yù)后評(píng)估的一個(gè)新的潛在表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物。

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