薛晨紅　張宏偉　彭芬　何聰芬　王巧娥　陳周　張建中

100044北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科［薛晨紅（現(xiàn)在河南省人民醫(yī)院皮膚科，450003鄭州）、彭芬、陳周、張建中］；中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所毒理室（張宏偉）；北京工商大學(xué) 北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（何聰芬、王巧娥）

細(xì)顆粒物PM2.5是指懸浮于空氣中空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的固態(tài)或液態(tài)顆粒物。皮膚直接暴露于空氣污染物中，時(shí)刻受到污染物的威脅［1］。PM2.5可能通過損害或降解角蛋白，破壞皮膚屏障致病［2］。研究表明，PM2.5不僅與外源性皮膚老化有關(guān)，而且與炎癥性皮膚病，如濕疹、特應(yīng)性皮炎（AD）的發(fā)生及嚴(yán)重程度相關(guān)［3?5］。毒理學(xué)研究表明，多環(huán)芳烴類為主的有機(jī)物、各種重金屬元素（尤其是水溶性金屬）及病原微生物可能是PM2.5起主要毒性作用的成分［6］。但基于PM2.5本身的特性及其吸附成分的復(fù)雜性，單一組分的研究并不能完全反映PM2.5對皮膚的整體危害效應(yīng)。我們收集北京市采暖季霧霾天氣PM2.5，探討PM2.5對HaCaT細(xì)胞形態(tài)、增殖、周期及凋亡的影響，為PM2.5在皮膚科領(lǐng)域的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞系來自北京大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科。澳洲胎牛血清及0.25%胰酶（美國Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司），CCK8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（日本Dojindo公司），細(xì)胞全蛋白提取試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物公司），鼠抗人細(xì)胞周期蛋白A2（cyclin A2）單克隆抗體、兔抗人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）單克隆抗體（美國Abcam公司），鼠抗人GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠、兔二抗（美國Santa Cruz公司），膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（annexin V?FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物公司）。

二、方法

1.PM2.5樣品采集及處理：選擇北京市東二環(huán)及東三環(huán)交界處，距地面約20 m的建筑物頂部為采樣地點(diǎn)。在12月至次年1月，運(yùn)用HY?1000智能大流量TSP采樣器（選配PM2.5切割器，青島恒遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司），使用石英濾膜采樣。平均采樣流量為1 000 L/min，每次連續(xù)采樣24 h。采樣后的石英濾膜于恒溫恒濕條件下平衡24 h。將濾膜剪成1 cm×1 cm后浸于75%乙醇中，水浴超聲振蕩60 min以洗脫顆粒物，保持水溫在20℃以下。洗脫液用70 μm濾網(wǎng)過濾到多個(gè)培養(yǎng)皿中，紫外燈殺菌，待大部分乙醇溶液揮發(fā)掉后再行冷凍干燥處理24 h，最后稱重。用無菌水配制成高濃度儲(chǔ)存液，-20℃保存。以上采集處理均由中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所毒理室完成。

2.實(shí)驗(yàn)分組及濃度設(shè)置：HaCaT細(xì)胞分為以下幾組，空白組，僅用細(xì)胞培養(yǎng)基，無細(xì)胞及PM2.5；對照組，不加PM2.5，其他條件同實(shí)驗(yàn)組；實(shí)驗(yàn)組，不同濃度PM2.5處理。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與CCK8法檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中設(shè)置50、100、200、400、800 mg/L 5個(gè)濃度組。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、凋亡及Western印跡法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白實(shí)驗(yàn)中設(shè)置100、200、400 mg/L 3個(gè)濃度組。

3.細(xì)胞培養(yǎng)與混懸液制備：在37℃、5%CO2、濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種，貼壁生長至50%～60%融合度時(shí)進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。用DMEM培養(yǎng)基將PM2.5儲(chǔ)存液稀釋成低濃度工作液。

4.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：HaCaT細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 ml。倒置顯微鏡下觀察PM2.5處理24 h后HaCaT細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。

5.CCK8法檢測細(xì)胞增殖：HaCaT細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。含不同濃度PM2.5培養(yǎng)基處理24 h后，吸棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1～2次，更換含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基每孔100 μl；加入10 μl CCK8檢測試劑，孵育90 min。用酶標(biāo)儀在雙波長（450 nm、630 nm）模式下測定各孔吸光度（A值）。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布：將HaCaT細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，含不同濃度PM2.5培養(yǎng)基處理24 h后，消化離心收集細(xì)胞，4℃PBS洗滌細(xì)胞1次，270×g離心5 min，棄上清液；以4℃預(yù)冷的2 ml 75%乙醇固定細(xì)胞至少1 h，離心棄固定液。配制細(xì)胞染色液，加入一定體積染色液（0.6～1.0 ml）重懸細(xì)胞沉淀物，避光室溫放置30 min；吹打混勻后用300目濾網(wǎng)過濾至流式管中上機(jī)檢測。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.Western印跡法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)：PM2.5處理24 h后收集細(xì)胞樣品，RIPA裂解液裂解細(xì)胞；BCA法測定蛋白濃度；每個(gè)加樣孔加入20 μg樣本蛋白進(jìn)行SDS?PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；按合適比例（1∶1 000～1∶4 000）稀釋 cyclin A2、CDK1和GAPDH一抗，4℃搖床孵育過夜；次日洗膜后室溫?fù)u床孵育二抗（1∶5 000稀釋）1 h，洗膜，曝光顯影。使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。根據(jù)目的條帶與GAPDH條帶的灰度比值計(jì)算相對灰度值，檢測cyclin A2、CDK1蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

8.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：PM2.5處理24 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液及用0.25%胰酶消化下來的細(xì)胞全部收集于離心管中，360×g離心5 min，棄上清液；4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，再次離心棄上清液；1×annexin?V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞沉淀物，調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 106個(gè)/ml；取100 μl細(xì)胞懸液置于流式管中，加入5 μl annexin?V溶液及10 μl PI工作液，室溫避光孵育15 min后再加入400 μl 1×annexin?V結(jié)合緩沖液，混勻后立即上流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞總凋亡率=早期細(xì)胞凋亡率+晚期細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，多組間及兩兩組間均值比較分別采用單因素方差分析（One?way ANOVA）及LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　不同濃度PM2.5對HaCaT細(xì)胞形態(tài)的影響（×100） 1A：對照組細(xì)胞形態(tài)均一，呈多角形；1B、1C：細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目均無明顯變化；1D：細(xì)胞數(shù)目有所減少，個(gè)別細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；1E：細(xì)胞數(shù)目明顯減少，部分細(xì)胞失去正常形態(tài)，漂浮細(xì)胞明顯增多；1F：可見大量漂浮細(xì)胞，僅少數(shù)細(xì)胞仍貼壁生長

結(jié)　果

一、PM2.5對HaCaT細(xì)胞形態(tài)的影響

見圖1。對照組及不同濃度PM2.5組（50、100、200、400、800 mg/L）HaCaT細(xì)胞處理24 h后，對照組細(xì)胞形態(tài)均一，分布均勻，貼壁緊密，呈典型鋪路石樣增殖（圖1A）；50、100 mg/L組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目變化均不明顯（圖1B、1C）；200 mg/L組細(xì)胞數(shù)目較對照組有所減少，個(gè)別細(xì)胞形態(tài)開始變得不規(guī)則（圖1D）；400 mg/L組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，部分細(xì)胞失去正常形態(tài)，漂浮死亡細(xì)胞明顯增多（圖1E）；800 mg/L組可見大量漂浮死亡細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞腫脹變形（圖1F）。

二、PM2.5對HaCaT細(xì)胞增殖的影響

各組間HaCaT細(xì)胞的存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=471.25，P＜0.001）。50 mg/L組細(xì)胞存活率為（98.49±1.44）%，對照組為（100±4.95）%，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；100、200、400、800 mg/L組細(xì)胞存活率分別為（91.77±2.04）%、（80.01±1.57）%、（57.80 ± 1.56）%、（21.98 ± 0.86）%，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著PM2.5濃度升高，細(xì)胞存活率明顯降低。

三、PM2.5對HaCaT細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，100～400 mg/L PM2.5處理HaCaT細(xì)胞24 h后，隨著PM2.5濃度的升高，G1期細(xì)胞比例無明顯變化，S期細(xì)胞比例逐漸增高，G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低，并呈濃度依賴關(guān)系（r值分別為0.91、-0.97，均P＜0.05），見表1。

四、PM2.5對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

見表1。與對照組相比，100、200、400 mg/L組cyclin A2、CDK1蛋白表達(dá)量均降低，200 mg/L組降低最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

五、PM2.5對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

對照組細(xì)胞總凋亡率為（6.24±0.17）%，100、200、400 mg/L組分別為（9.98±0.21）%、（12.56±0.74）%、（16.74± 1.48）%，細(xì)胞總凋亡率呈濃度依賴性升高（r=0.97，P＜0.05）。見圖3。

表1　不同濃度PM2.5處理HaCaT細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期分布及相關(guān)蛋白表達(dá)變化（x±s）

圖2　不同濃度PM2.5對HaCaT細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞周期蛋白（cyclin）A2及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）蛋白的影響　1：對照組；2：100 mg/L PM2.5組；3：200 mg/L PM2.5組；4：400 mg/L PM2.5組。GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶

圖3　流式細(xì)胞儀檢測不同濃度PM2.5處理HaCaT細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡率

討　論

PM2.5化學(xué)組分復(fù)雜，主要包括無機(jī)成分、有機(jī)成分、元素碳、微量金屬元素、微生物［7］。既往PM2.5在體外的毒理學(xué)研究多集中在呼吸道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等，但對皮膚細(xì)胞的研究不多［8］。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，HaCaT細(xì)胞在PM2.5處理24 h后，隨著PM2.5濃度升高（0～400 mg/L），細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，漂浮細(xì)胞逐漸增多；細(xì)胞存活率逐漸下降，細(xì)胞增殖明顯受限。這與Li等［9］的研究結(jié)果基本一致，說明PM2.5可對HaCaT細(xì)胞造成明顯的毒性損傷。

已知細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，而細(xì)胞周期調(diào)控是一個(gè)精妙復(fù)雜的過程，受cyclin和CDK兩大家族基因的控制。我們用100～400 mg/L PM2.5處理HaCaT細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞比例逐漸升高，G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低，提示PM2.5導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞阻滯于DNA合成期，即S期。進(jìn)一步檢測S期進(jìn)展相關(guān)蛋白cyclin A2、CDK1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)cyclin A2、CDK1的表達(dá)水平均有一定程度下降，這種變化趨勢與S期HaCaT細(xì)胞比例升高趨勢相一致。進(jìn)一步研究PM2.5對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)隨著PM2.5濃度從100 mg/L升高至400 mg/L時(shí)，細(xì)胞平均凋亡率由9.98%升高至16.74%，說明PM2.5可一定程度促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡。丁曉潔［10］在研究PM2.5對人支氣管上皮細(xì)胞增殖的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，PM2.5可通過誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯及一定程度促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制支氣管上皮細(xì)胞增殖。覃輝艷等［11］研究發(fā)現(xiàn)，廣州市霧霾天氣PM2.5可誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞（16?HBE）凋亡，抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。角質(zhì)形成細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞同屬上皮來源，研究結(jié)果的相似性提示PM2.5可能通過誘導(dǎo)S期阻滯導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞增殖受限，且S期阻滯可能與cyclin A2、CDK1蛋白的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。由于PM2.5的具體成分因采樣時(shí)期、地點(diǎn)不同而有所差別，其對機(jī)體造成的損傷程度及相關(guān)機(jī)制也可能不同。本實(shí)驗(yàn)采集的是北京市霧霾天氣PM2.5，其誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，包括引起細(xì)胞形態(tài)改變、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯，一定程度促進(jìn)細(xì)胞凋亡，相關(guān)毒性機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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