彭 　鵬 王潮崗 徐新云 * 夏俊杰黃海燕王 　利黃奕欽楊 　晨

（1．深圳市疾病預防控制中心毒理研究所，廣東 　深 圳 　518055；2．深圳大學生命與海洋科學學院，廣東 　深 圳 　518060；3．南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南 　衡 陽 　421001）

鄰苯二甲酸酯類(phthalate acid esters，PAEs)化合物是常見的塑化劑，一般為無色油狀黏稠液體，難溶于水，易溶于有機溶劑，常溫下不易揮發(fā)。我國常用PAEs的品種包括鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]、鄰苯二甲酸二辛酯(dioctyl phthalate，DOP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(diisooctyl phthalate，DIOP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)等30多種化合物。DEHP屬于環(huán)境內分泌干擾物之一，具有生殖毒性、胚胎發(fā)育毒性、遺傳毒性、免疫毒性[1-7]。大量動物實驗及體外實驗研究表明，DEHP主要通過雌激素樣作用、干擾內分泌調節(jié)而作用于生殖系統(tǒng)。類固醇合成急性調節(jié)蛋白(steroidogenio acute regulatory protein，StAR)是類固醇激素合成過程中的重要調節(jié)因素，StAR是一類膽固醇轉運蛋白，可促進類固醇激素合成細胞中膽固醇自線粒體外膜轉運至內膜，進而轉化合成類固醇激素，是該類激素合成的限速步驟[8-10]。本實驗室前期研究表明，DEHP染毒后動物睪丸和卵巢組織中StAR基因表達水平升高，StAR基因可能在DEHP致生殖毒性中發(fā)揮重要的作用[2-3]。為了深入研究DEHP的生殖內分泌毒性機制，本文通過分子克隆技術，應用慢病毒載體構建StAR基因高表達的細胞，研究StAR基因高表達對DEHP致細胞凋亡的影響，為進一步研究DEHP的生殖毒性機制提供科學依據。

1　材料與方法

1.1　主要試劑

限制性內切酶EcoR I、Xho I，T4 DNA連接酶，均購于美國Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒RNeasy Mini試劑盒(德國QIAGEN公司)，Prime Scrip RT reagent Kit和SYBR Primescript RT-PCR Kit(中國 TAKARA公司)，質粒小量提取和無內毒素質粒小量提取試劑盒(美國OMEGA Bio-tek公司)，J107大腸桿菌感受態(tài)(天根生物公司)，真核表達載體pLVX-mCUV-ZSgreen-PGLC-Puro(以下簡稱pLVX載體，Biovector公司)，包裝輔助質粒PLVX-GFP和該質粒對應的慢病毒包裝試劑盒 (美 國 Clontech公 司 )， 293FT細 胞 (美 國 Invitrogen公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)，人乳腺癌MCF-7細胞(中國上海細胞庫)，StAR基因PCR引物由上海生工合成，兔抗StAR(ab133657)一抗為美國Santa Cruz公司產品，羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP均為美國Thermo Scientific 公司產品。

1.2　StAR cDNA的擴增及其克隆載體構建

根據GenBank的StAR基因序列對所需引物進行設計，序列如下：F，5′-GGAATTCCAGGAAACAATGCT GCTAG-3′(EcoR Ⅰ)；R，5′-CCCTCGAGCAGGCTGGT CTTCAACAC-3′(Xho I)。按照Premix PrimeSTARHS的使用說明配置反應體系進行PCR，退火溫度為72℃。PCR完成后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后用DNA膠回收試劑盒回收PCR產物，并再用ExTaq酶進行加A尾反應。按照pLVX載體的說明書，將加A尾產物與pLVX載體連接，轉化J107感受態(tài)細菌。常規(guī)篩選鑒定，挑取小量培養(yǎng)的PCR鑒定陽性克隆的細菌菌液，送至生工生物工程(上海)有限公司測序確認。

1.3　慢病毒載體構建與包裝

挑取測序正確的重組T載體，先進行Xho I酶切，用核酸共沉劑回收酶切產物后，再用EcoR I酶切。電泳鑒定后，用DNA膠回收試劑盒回收酶切產物，然后將其與經過相同處理的pLVX-GFP載體連接，轉化J107感受態(tài)細菌。小量培養(yǎng)篩選出來的細菌，提取重組質粒進行PCR鑒定，并將菌液送至上海生工測序。挑取測序正確的重組pLVX-GFP載體，用pLVX-GFP載體對應的慢病毒包裝試劑盒將pLVX-GFP載體和包裝載體共轉染到293FT細胞中，置于37 ℃培養(yǎng)48 h后將上清培養(yǎng)基用0.45 μmol/L濾膜過濾，收集病毒上清，使用Lenti-X GoStix金標試劑盒測定病毒滴度，然后保存于-80 ℃。

1.4　慢病毒轉染MCF-7細胞

將3×105個MCF-7細胞接種于25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)18 h后細胞匯合度達到50%，取病毒上清用RPMI-1640完全培養(yǎng)基按1∶1稀釋后，再加入Polybrene至終濃度為6～10 μg/mL。去除培養(yǎng)瓶中原有的完全培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍后加人上述含慢病毒的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。轉染24 h，去除含慢病毒的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，加入正常的RPMI-1640完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，然后換用1 μg/mL嘌呤霉素對細胞進行篩選，每隔2 d換液1次，篩選時間為7 d。

1.5　StAR高表達細胞株的鑒定

1.5.1熒光定量PCR檢測StAR mRNA表達水平分別接種MCF-7細胞和上述1.4轉染StAR基因的MCF-7細胞(3×105個)，培養(yǎng)細胞24 h后至細胞密度為80%。按照RNeasy Mini Kit說明書，提取細胞總RNA；用Prime Scrip RT reagent Kit將總RNA反轉錄為cDNA。分別取兩種細胞的cDNA各1 μL為模板進行熒光定量PCR，檢測StAR mRNA表達量的變化，確認StAR高表達細胞株。

1.5.2Western blot檢測StAR蛋白表達水平 將正常MCF-7細胞、轉染StAR基因的MCF-7細胞分別接種到25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶(1×106個)。培養(yǎng)約24 h后待細胞匯合度達90%后去除培養(yǎng)基，吸棄細胞培養(yǎng)液，用冷PBS洗3次，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，100 ℃變性8 min；用二辛可寧酸法(bicinchoninic acid assay，BCA法)進行蛋白定量。總蛋白進行10% SDS-PACE電泳分離，接著將蛋白電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。根據Marker和分子量將膜上含β-actin(43 kD)，StAR蛋白(32 kD)的部分分別切下，加入相應的一抗，冰上孵育過夜；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入對應的二抗，室溫孵育1 h；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入Western blot化學發(fā)光試劑后用冷CCD成像系統(tǒng)對其進行曝光拍照，所得圖像用Image J軟件進行條帶灰度定量分析。以β-actin為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.6　DEHP處理細胞

將正常MCF-7細胞和StAR基因高表達的MCF-7細胞分別接種到6孔板上，待細胞融合度達80%進行DEHP染毒，DEHP染毒濃度分別為0(溶劑對照)、0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mmol/L，染毒24 h，將6孔板中的染毒液去除干凈，用PBS清洗細胞兩次，提取細胞總RNA，用分光光度計測定RNA濃度，反轉錄后進行熒光定量PCR。

1.7　熒光定量PCR檢測凋亡相關基因mRNA的表達

按1.6的方法用DEHP染毒MCF-7細胞后，分別提取各個劑量組細胞總RNA，反轉錄為cDNA。RT反應體系是：5×Prime Script緩沖液4 μL，Prime Script RT酶 Mix I 1.0 μL， Oligo dT引 物 (50 μmol/L)1.0 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)1.0 μL，總RNA 1 μg，加RNase Freed H2O至20 μL。反轉錄條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、10 min，-20 ℃冰箱保存反轉錄樣品。目的基因Bax，Caspase-3，Caspase-8的熒光PCR引物委托上海生工公司合成，引物序列如下：Bax，正向5′-GCCAGCAAACTGGTGCTCAA-3′，反向5′-ATGTCCAGCCCATGATGGTTC-3′； Caspase-3， 正向 5′-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3′， 反 向5′-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3′； Caspase-8，正向5′-CAAATGCAAACTGGATGATGAC-3′，反向5′-AGCAGGCTCTTGTTGATTTGG-3′；GAPDH，正向5′-TCCTGCACCACCAACTGCTT-3′，反向5′-GTCTTCTGG GTGGCAGTGAT-3′。熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH的CT值 為內參，目的基因CT值 采用2-ΔΔCT法計算后的比值即為各基因的相對表達量，此步驟由ABI 7900HT分析軟件自動計算并直接給出結果。

1.8　Western blot檢測StAR蛋白和凋亡蛋白的表達

DEHP染毒MCF-7細胞后，用細胞裂解液提取細胞總蛋白；用二辛可寧酸法(BCA法)進行蛋白定量。配制10%分離膠，5%濃縮膠，依次加入蛋白樣品；濃縮膠于80 V條件下電泳30 min，分離膠于120 V條件下電泳50 min。SDS-PAGE凝膠電泳結束后，按0.8 mA/cm2膠面積設定轉膜電流，恒流轉膜100 min，將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。將PVDF膜放在一抗(抗StAR、Bax、Caspase-3、Caspase-8)(1∶300)稀釋液中4 ℃環(huán)境中過夜孵育，然后用TBST溶液洗3次，每次10 min。按1∶2 000比例稀釋HPR標記的羊抗鼠二抗、HPR標記的羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光試劑，在冷CCD成像系統(tǒng)里觀察結果。

1.9　統(tǒng)計學分析

實驗結果運用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，StAR基因高表達組與對照組、DEHP實驗組和對照組之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗，數據以x±s表示，以α=0.05為檢驗水準。

2　結果

2.1　StAR慢病毒載體測序鑒定結果

StAR基因高表達慢病毒載體的測序結果表明，外源基因插入位點正確，并且插入序列與GenBank上提供的信息完全相符，部分測序結果如圖1所示。

2.2　StAR慢病毒重組載體構建與病毒包裝鑒定

應用瓊脂糖凝膠電泳分析StAR基因的PCR擴增產物，可見明顯條帶，大小約1 000 bp，與預期相符。將含PCR產物的重組pLVX載體經上海生工測序，與GenBank上該基因的序列完全相符。

圖1　StAR慢病毒載體測序鑒定結果

圖2　PCR擴增StAR基因電泳結果

2.3　熒光定量PCR檢測StAR基因轉染細胞株中StAR mRNA相對表達水平

將正常MCF-7細胞的StAR基因表達量作為對照，數值設為1，StAR基因轉染MCF-7細胞的StAR mRNA表達量比正常MCF-7細胞提高591.9倍(p＜0.01)。

2.4　Western blot檢測StAR基因轉染細胞株中StAR蛋白相對表達水平

以β-actin蛋白為內參，檢測MCF-7細胞和StAR基因轉染MCF-7細胞StAR蛋白表達水平，經歸一化處理后的灰度分析結果顯示，StAR基因轉染MCF-7細胞中StAR蛋白含量比MCF-7細胞升高190%(p＜0.01)。

圖3　Western blot檢測StAR蛋白表達水平

2.5　DEHP對StAR基因高表達細胞中凋亡基因mRNA表達水平的影響

0.10～0.8 mmol/L DEHP染毒MCF-7細胞后，Bax和Caspase-3 mRNA表達水平較對照組(0 mmol/L DEHP)顯著升高；0.05～0.8 mmol/L DEHP染毒時Caspase-8 mRNA表達水平較對照組顯著升高；不同濃度DEHP染毒StAR高表達細胞后，Bax和Caspase-8 mRNA表達水平在染毒濃度為0.05～0.8 mmol/L時顯著升高，Caspase-3 mRNA在染毒濃度為0.1～0.8 mmol/L時表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01)，見圖4。

2.6　DEHP對StAR基因高表達細胞中凋亡基因蛋白表達水平的影響

Western blot結 果 顯 示 ， DEHP染 毒 MCF-7細 胞后，0.2～0.8 mmol/L DEHP染毒組Bax蛋白質較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；0.1～0.8 mmol/L DEHP染毒組Caspase-3蛋白較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01)；0.2～0.8 mmol/L DEHP染毒組Caspase-8蛋白表達較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。在DEHP 0.2 mmol/L劑量下，與同染毒劑量組的MCF-7細胞比較，StAR高表達細胞Caspase-3蛋白表達水平下降(p＜0.01)；DEHP其他劑量下，StAR高表達細胞Bax、Caspase-3和Caspase-8蛋白表達與同染毒劑量組的MCF-7細胞比較均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01)，結果見圖5～7。

3　討論

圖4　不同劑量DEHP染毒對MCF-7細胞和StAR基因轉染細胞凋亡相關基因表達水平的影響

圖5　DEHP染毒對MCF-7細胞和StAR基因高表達細胞Bax蛋白表達水平的影響

圖6　DEHP染毒對MCF-7細胞和StAR基因高表達細胞Caspase-3蛋白表達水平的影響

圖7　DEHP染毒對MCF-7細胞和StAR基因高表達細胞Caspase-8蛋白表達水平的影響

近年來DEHP的生殖毒性已有明確結論[1-7]，但是還存在很多沒有解決的問題，比如DEHP究竟會引起哪些具體的基因及蛋白質的改變、DEHP是通過何種信號通路來啟動它的損傷機制的，在損傷過程中會引起哪些激素水平的改變等。文獻檢索發(fā)現，國際上對于生殖有關的基因調控進行了許多研究，例如類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白StAR基因與雄性激素合成調控密切相關，StAR基因位于8號染色體上，其編碼的蛋白產物是StAR蛋白，StAR基因對睪酮的生物合成具有重要的意義，對整個雄激素合成過程至為關鍵[9，11]。StAR蛋白位于線粒體內，在線粒體外膜發(fā)揮作用。StAR基因表達調控是一個非常復雜的過程，包括多種激素和信號途徑協(xié)調轉錄機制合作與互動，以及若干支配轉錄后的mRNA和蛋白表達機制[12]。研究表明StAR基因的表達紊亂會引起多囊卵巢綜合征等在內的多種內分泌紊亂型疾病的發(fā)生發(fā)展。StAR基因是類固醇激素合成過程中的限速酶也是關鍵酶，其表達可受到機體應激狀態(tài)的影響。所以本課題主要研究DEHP對乳腺癌細胞中StAR基因表達的影響。

Bax基因是Bcl-2基因家族中的一員，其表達產物可形成異源二聚體，進而導致細胞凋亡加速發(fā)生。在正常細胞中Bax蛋白通常存在于細胞質中，受到一系列死亡信號的刺激后會轉移到線粒體內，一旦到達線粒體的外膜，就會導致線粒體功能異常并引發(fā)凋亡。Caspase-3是凋亡中發(fā)揮起始和執(zhí)行作用的蛋白，也是最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是凋亡的主要效應因子，其活化意味著凋亡浸入不可逆階段，Caspase-8則是凋亡的啟動因子，在自我活化后能激活凋亡執(zhí)行，因此3種凋亡基因表達水平的變化表明，DEHP染毒對StAR基因高表達細胞的凋亡基因有顯著影響，并且與正常MCF-7細胞相比，DEHP對StAR基因高表達細胞的凋亡基因表達具有顯著的促進作用。本文結果顯示，StAR基因高表達細胞中凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-8的表達水平隨DEHP濃度增加而增加。當DEHP染毒劑量在中劑量和高劑量時，StAR基因高表達細胞和正常MCF-7細胞凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-8的mRNA表達水平均顯著高于未染毒的對照組，且StAR基因高表達細胞明顯高于正常MCF-7細胞。該結果提示StAR基因促進了凋亡相關基因的表達，推測其原因可能是DEHP染毒后在StAR基因高表達細胞中具有促進凋亡基因活化的作用。

DEHP與我們生活環(huán)境密切相關，DEHP是當今社會非常關注的環(huán)境污染物之一，幾乎存在于生活中的各個領域，包括塑料制品、食品包裝袋、兒童玩具、血袋，透析袋以及醫(yī)用導管中，其作用是增加塑料的可塑性和柔韌性，提高塑料強度，其含量可高達終產品的50%[13-14]。本文結果表明，DEHP具有顯著促進凋亡基因表達的生物學作用，而且StAR基因高表達細胞比正常MCF-7細胞的凋亡基因表達水平更高，提示StAR基因高表達具有促進DEHP的致凋亡作用，為深入研究DEHP的生殖毒性提供了科學依據。

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