任雪丹 李　諾呂中明 * 王民生*

（1．東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇　南京　210009；2．江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇　南京 　210009）

鄰苯二甲酸二辛酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)是鄰苯二甲酸酯類(lèi)(phthalates acid esters，PAEs)的重要成員，也是近代全球使用最為廣泛的塑料增塑劑之一，被認(rèn)為是廣泛的環(huán)境持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，POPs)。DEHP主要用于生產(chǎn)柔性聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)塑料，賦予聚氯乙烯塑料柔韌性，可以占軟PVC的40%。由于其實(shí)用性和成本效益，DEHP被廣泛用于消費(fèi)產(chǎn)品，包括玩具、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、化妝品、農(nóng)藥、涂料、印染、室內(nèi)裝修材料、藥品和食品包裝材料[1-4]。由于DEHP與塑料基質(zhì)之間是以不牢固的氫鍵和范德華力連接，所以伴隨使用時(shí)間的推移，DEHP不斷地從塑料中逸出，揮發(fā)至大氣、土壤、水域中，造成環(huán)境介質(zhì)、生物、食品等的污染。眾多研究表明，DEHP是重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有雄性、雌性生殖內(nèi)分泌毒性、肝腎毒性、神經(jīng)毒性和遺傳毒性等多種生物毒性，并帶來(lái)生物血液和生化方面的改變[5-11]。本研究擬通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行不同劑量的DEHP喂飼染毒，用ADVIA2120i型全自動(dòng)五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀測(cè)定各組大鼠血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板等生理指標(biāo)的變化，以期研究DEHP亞慢性暴露對(duì)大鼠血細(xì)胞的影響。

1　材料與方法

1.1　主要試劑與儀器

DEHP(純度≥99.5%，美國(guó)Sigma公司)、一次性塑料培養(yǎng)皿(美國(guó)Corning 公司)、1.5 mL EP管(美國(guó)Corning公司)；ADVIA2120i型全自動(dòng)五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀(德國(guó)Siemens公司)

1.2　動(dòng)物飼養(yǎng)與分組

1.2.1動(dòng)物的分組 健康清潔級(jí)SD大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量為70～90 g。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京) 2012-0001，質(zhì)量合格證號(hào)11400700158173。在適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將受試大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組(飼喂基礎(chǔ)飼料)、4個(gè)DEHP染毒組(染毒劑量分別為5、50、500和2 500 mg/kg)，每組20只，雌雄各半，單籠飼養(yǎng)。

1.2.2動(dòng)物的飼養(yǎng) 大鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2012-0037。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～26 ℃，濕度為40%～70%。各劑量組按相應(yīng)比例將DEHP均勻拌入飼料中，將飼料以平均每日動(dòng)物體質(zhì)量8%的攝食量按組別給予大鼠，連續(xù)飼喂染毒90 d。染毒期間，大鼠可自由飲水、攝食。

1.3　指標(biāo)與方法

1.3.1體質(zhì)量及食物利用率 觀察并記錄大鼠在飼養(yǎng)期間的一般情況(如日常行為表現(xiàn)、中毒和死亡情況等)；于每周稱(chēng)量記錄體質(zhì)量、攝食量，并計(jì)算總的食物利用率(總食物利用率=總增質(zhì)量/總攝食質(zhì)量×100%)。

1.3.2血細(xì)胞參數(shù)測(cè)定方法 90 d喂養(yǎng)結(jié)束后，大鼠空腹16 h稱(chēng)量并記錄最終空腹體質(zhì)量，用滴加EDTA抗凝劑的1.5 mL EP管分別取雌雄大鼠全血1.0 mL，應(yīng)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀立即進(jìn)行血細(xì)胞分析。檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(BASO)、單核細(xì)胞(MONO)、淋巴細(xì)胞(LYM)、紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、直接測(cè)定的血紅蛋白濃度(CHCM)、血紅蛋白含量分布寬度(HDW)、血小板總數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)和未染色的大細(xì)胞數(shù)量(LUC)以及其相應(yīng)的百分比等指標(biāo)。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間均數(shù)比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組用Dunnett’s法比較；組間率的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。所有結(jié)果用 表示，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1　DEHP對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

在染毒期間，對(duì)照組經(jīng)觀察均未出現(xiàn)異?，F(xiàn)象；與對(duì)照組比較，DEHP 5、50和500 mg/kg劑量組均未觀察到明顯的差異；而2 500 mg/kg DEHP染毒組動(dòng)物則均表現(xiàn)出精神亢奮、被毛蓬松、局部脫毛(頭頸部和四肢以及腹部)等中毒體征，攝食量減少，大鼠體質(zhì)量在染毒后顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1　不同劑量DEHP染毒對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響(g，-，n=10)

表1　不同劑量DEHP染毒對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響(g，-，n=10)

與對(duì)照組相比，*p＜0.05.

分組(mg/kg) 雄性 雌性染毒前 染毒后 染毒前 染毒后對(duì)照組 78.7±4.1 552.0±23.7 77.7±5.0 312.1±33.9 DEHP 5 78.9±3.6 554.0±39.1 78.5±3.9 327.7±30.7 50 77.9±3.4 544.3±35.2 79.1±5.3 344.7±27.3 500 79.3±2.9 551.2±23.9 79.6±5.3 321.4±39.3 2 500 79.5±4.6 408.1±18.8* 79.9±5.9 273.8±13.6*

2.2　不同染毒劑量DEHP對(duì)大鼠食物利用率的影響

在DEHP染毒期間，5、50和500 mg/kg劑量組的體質(zhì)量和攝食量與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而2 500 mg/kg劑量組的大鼠體質(zhì)量和攝食量與對(duì)照組相比明顯下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2　不同劑量DEHP染毒對(duì)大鼠食物利用率的影響(-x±s，n=10)

2.3　DEHP對(duì)大鼠白細(xì)胞的影響

見(jiàn)表3。結(jié)果表明，2 500 mg/kg組雄性大鼠嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)顯著減少，雌性大鼠白細(xì)胞總數(shù)(WBC)顯著降低，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。在500和2 500 mg/kg劑量下，雌性大鼠淋巴細(xì)胞(LYM)與對(duì)照組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。

表3　不同劑量DEHP染毒對(duì)大鼠白細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響(-x±s，n=10)

2.4　DEHP對(duì)大鼠紅細(xì)胞的影響

如表4所示。由表4可見(jiàn)，在雄性大鼠中，2 500 mg/kg DEHP染毒組紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)和紅細(xì)胞壓積(HCT)與對(duì)照組相比顯著下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。

在雌性大鼠中，DEHP 500 mg/kg和2 500 mg/kg組血紅蛋白(HGB)顯著下降，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。平均血紅蛋白含量(MCH)隨著劑量的增加而降低，呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，在500 mg/kg和2 500 mg/kg劑量下與對(duì)照組相比顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。在2 500 mg/kg劑量下，平均血紅蛋白濃度(MCHC)和直接測(cè)定的血紅蛋白濃度(CHCM)與對(duì)照組相比顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。

表4　不同劑量DEHP染毒對(duì)大鼠紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響(-x±s，n=10)

2.5　不同染毒劑量DEHP對(duì)大鼠血小板的影響

見(jiàn)表5。在DEHP染毒期間，未發(fā)現(xiàn)其對(duì)大鼠血小板各項(xiàng)指標(biāo)產(chǎn)生影響。

表5　不同劑量DEHP染毒對(duì)大鼠血小板相關(guān)指標(biāo)的影響(，n=10)

表5　不同劑量DEHP染毒對(duì)大鼠血小板相關(guān)指標(biāo)的影響(，n=10)

平均血小板體積/fL分組(mg/kg)平均血小板體積/fL雄性 雌性血小板總數(shù) 血小板總數(shù)(×10/μL)3(×10/μL)3對(duì)照組 900.6±157.9 7.53±0.78 933.0±121.8 7.23±0.47 DEHP 5 1 008.7±133.5 6.82±0.82 973.8±114.3 6.96±0.45 50 1 042.7±55.1 7.71±0.57 908.6±136.8 6.98±0.48 500 955.6±205.1 7.02±0.41 985.4±94.1 7.13±0.36 2 500 864.0±153.4 8.26±0.91 1 034.2±106.2 7.92±0.60

3　討論

從DEHP亞慢性染毒對(duì)大鼠體質(zhì)量、增質(zhì)量、總攝食量及食物利用率的影響結(jié)果來(lái)看，隨著染毒劑量的增加，DEHP 2 500 mg/kg組大鼠的體質(zhì)量、體質(zhì)量的增量、總攝食量與對(duì)照組相比顯著下降，提示，DEHP亞慢性暴露對(duì)大鼠的體質(zhì)量和攝食量有一定的影響。

白細(xì)胞是血液細(xì)胞的一種，通常也被稱(chēng)為免疫細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)更新的速度比較快。作為免疫系統(tǒng)的一部分，具有防御和免疫功能，參與對(duì)細(xì)菌、病毒等異物入侵時(shí)的免疫過(guò)程，白細(xì)胞各項(xiàng)指標(biāo)的變化是機(jī)體免疫力變化的標(biāo)志[12]。在DEHP 500 mg/kg劑量下，雌性大鼠淋巴細(xì)胞(LYM)與對(duì)照組相比顯著增加(p＜0.05)，2 500 mg/kg劑量時(shí)，淋巴細(xì)胞(LYM)持續(xù)增加(p＜0.05)，白細(xì)胞總數(shù)(WBC)顯著降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，說(shuō)明高劑量的DEHP可能影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能，對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性并破壞白細(xì)胞。這也和有關(guān)DEHP在高濃度下，可使自由基產(chǎn)生增加，影響機(jī)體的抗氧化酶系和引起氧化損傷，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性的報(bào)道結(jié)果相一致[13]。研究[14-16]表明，DEHP具有“佐劑”的作用，能增強(qiáng)免疫原性的活力、誘發(fā)哮喘、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化和分泌促炎性因子，加重炎癥過(guò)敏反應(yīng)。

紅細(xì)胞負(fù)責(zé)供給全身組織和細(xì)胞所需的O2，帶走其產(chǎn)生的部分CO2，對(duì)機(jī)體的正常運(yùn)行具有重要作用。紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)和紅細(xì)胞壓積(HCT)主要用來(lái)判斷有無(wú)貧血及貧血的程度，較為常見(jiàn)的是3者降低即為貧血，根據(jù)HGB降低程度劃分貧血程度[17]。由本研究結(jié)果可見(jiàn)，在雄性大鼠中，2 500 mg/kg組紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)和紅細(xì)胞壓積(HCT) 與對(duì)照組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。說(shuō)明2 500 mg/kg劑量下，DEHP可對(duì)大鼠的紅細(xì)胞產(chǎn)生一定的影響。平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)和直接測(cè)定的血紅蛋白濃度(CHCM)均為紅細(xì)胞的平均值，據(jù)此可進(jìn)行貧血的形態(tài)學(xué)分類(lèi)[18]。在雌性大鼠中，平均血紅蛋白含量(MCH)隨著劑量的增加而降低，在500 mg/kg和2 500 mg/kg劑量下與對(duì)照組相比顯著下降(p＜0.05或p＜0.01)。同時(shí)，平均血紅蛋白濃度(MCHC)和直接測(cè)定的血紅蛋白濃度(CHCM) 在2 500 mg/kg劑量下與對(duì)照組相比顯著降低(p＜0.05或p＜0.01)，說(shuō)明機(jī)體發(fā)生了嚴(yán)重貧血，血紅蛋白含量顯著下降，從而攜帶O2和CO2的能力也顯著降低。

血小板的功能主要是促進(jìn)止血和加速凝血，以及維護(hù)毛細(xì)血管壁完整性。在本實(shí)驗(yàn)中，不同劑量的DEHP對(duì)大鼠血小板的指標(biāo)無(wú)顯著影響。說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)中，DEHP對(duì)大鼠的凝血止血功能無(wú)顯著影響。

綜上所述，一定劑量的DEHP會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠的體質(zhì)量、攝食量和血液系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

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