陳 　強(qiáng) 靳廣毅 林桂淼劉 　好許改霞王曉梅*

（1. 深 圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東　深圳　518060；2. 深圳大學(xué)光電子器件與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 　深 圳 　518060）

多年以來，人們普遍接受男性體細(xì)胞表現(xiàn)為XY基因型，而女性則表現(xiàn)為XX基因型。隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究方法的進(jìn)步，科學(xué)家在許多女性的不同組織和器官中均發(fā)現(xiàn)了含有Y染色體的細(xì)胞，這些細(xì)胞被稱為微嵌合體(microchimerism)。

關(guān)于微嵌合體的形成機(jī)制目前學(xué)術(shù)界存在不同的觀點(diǎn)。Nelson[1-2]認(rèn)為微嵌合體可能來源于通過胎盤屏障而滯留于母體的男性胎兒細(xì)胞，或者來源于男性胎兒游離DNA與母體體細(xì)胞的融合。然而這種觀點(diǎn)在隨后的一些臨床和實(shí)驗(yàn)研究中受到極大的挑戰(zhàn)，因?yàn)樵S多研究發(fā)現(xiàn)微嵌合體不僅存在于孕育過男胎的母親，也存在于未受孕過的女性[3-5]。

近年來，微嵌合體在許多女性多個(gè)組織和器官中的發(fā)現(xiàn)提示精子與女性體細(xì)胞發(fā)生融合的可能性，而一些女性腫瘤組織相對(duì)于周邊正常組織有較高的嵌合細(xì)胞比例提示精子可能更容易與腫瘤細(xì)胞發(fā)生融合[6-7]。然而，目前尚未見精子與腫瘤細(xì)胞體外融合的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。據(jù)此，我們以小鼠精子和腫瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象，體外建立精子與腫瘤細(xì)胞融合模型，并對(duì)該模型的生物特征進(jìn)行了初步研究。

1　材料與方法

1.1　主要試劑和儀器

本研究中使用的主要儀器和試劑包括：FV10i型共聚焦顯微鏡(Olympus)，35 mm培養(yǎng)皿(Corning Costar)，濾孔直徑40 μm的過濾皿(Thermo Scientific)，嵌套式的培養(yǎng)皿/板(Corning Costar)，35 mm共聚焦皿(皿底玻璃片直徑10 mm，MatTek)，DAPI(Sigma)以及DiI羰花青染料(Beyotime)等。

1.2　腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞系(表1)均為深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院納米磁實(shí)驗(yàn)室保存，細(xì)胞維持及凍存、復(fù)蘇均按照美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC) 推薦的方法進(jìn)行。

表1　實(shí)驗(yàn)中涉及的細(xì)胞系及其培養(yǎng)條件

1.3　精子與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)基

以RPMI 1640和Ham’s F10的混合培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，我們合成了一種新型的供精子與體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并命名為STCM(sperm-tumor co-culture medium)。在STCM中加入不同濃度的胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)分別配制成獲能液(含3%BSA)和共培養(yǎng)液(含0.3% BSA)。我們對(duì)STCM和傳統(tǒng)使用的RPMI 1640在支持腫瘤生長(zhǎng)及支持精子與腫瘤細(xì)胞融合特性(融合率和融合時(shí)間)進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)。

1.4　小鼠精子的獲取及獲能處理

取8～10周齡雄性C57BL/6小鼠(購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢疫編號(hào)44007200016312)，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，半晝半夜，自由取食、取水。經(jīng)1周左右適應(yīng)期后的動(dòng)物用于精子獲取。實(shí)驗(yàn)前一天準(zhǔn)備獲能液于35 mm培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過夜。

常規(guī)切取小鼠附睪組織，并置于平衡過夜后的獲能液中，在無菌條件下剪碎附睪組織后置于濾孔直徑為40 μm的過濾皿中過濾，將過濾后的精子吸入1.5 mL EP管并置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置，使精子上游15 min，具體過程參照世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的步驟[8]進(jìn)行。取出EP管，吸取上層運(yùn)動(dòng)活躍的精子用于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.5　共培養(yǎng)前的準(zhǔn)備

共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前將待實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞接種密度為30～40/mm2，待單個(gè)集落的細(xì)胞數(shù)量為4～8個(gè)時(shí)進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前以Hanks液清洗接種細(xì)胞的培養(yǎng)皿3次，每次5 min，然后向培養(yǎng)皿內(nèi)添加500 μ L共培養(yǎng)基，準(zhǔn)備與精子共培養(yǎng)。

1.6　精子與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)及對(duì)照研究

取5 μL經(jīng)上游處理后的精子于精子分析儀進(jìn)行精子計(jì)數(shù)。另取適量精子(精子與腫瘤細(xì)胞的配比為40∶1～50∶1)置于接種腫瘤細(xì)胞的35 mm培養(yǎng)皿并補(bǔ)足液體總量至1.5 mL。然后迅速將培養(yǎng)皿置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置0.5、1、1.5和2 h共4個(gè)觀察點(diǎn)，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況并進(jìn)行拍照。

本研究設(shè)立了空白對(duì)照和嵌套式培養(yǎng)兩個(gè)對(duì)照研究。嵌套式的培養(yǎng)皿/板能夠在屏蔽精子和腫瘤細(xì)胞直接接觸的同時(shí)而使兩種細(xì)胞處于同一培養(yǎng)體系中。

1.7　嵌合型腫瘤細(xì)胞的共聚焦顯微鏡成像

將腫瘤細(xì)胞接種于35 mm共聚焦皿。腫瘤細(xì)胞與精子的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)按常規(guī)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)4 h，每隔30 min設(shè)立1個(gè)觀察點(diǎn)。在每個(gè)觀察點(diǎn)首先常規(guī)固定殘存于培養(yǎng)皿底部的腫瘤細(xì)胞，然后以0.1 mg/mL DAPI和10 μmol/L DiI羰花青染料分別染色細(xì)胞核和細(xì)胞膜10 min。以FV10i型共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像。三維共聚焦成像時(shí)，首先進(jìn)行分層掃描，然后以成像系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行三維重建，進(jìn)行單個(gè)三維共聚焦成像需進(jìn)行30～40層的分層圖像。

1.8　精子與腫瘤細(xì)胞融合率的估算方法

以MTT法測(cè)得的空白對(duì)照組D(490)估計(jì)參與共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的腫瘤細(xì)胞總數(shù)；以共培養(yǎng)后殘存的貼壁腫瘤細(xì)胞的D(490)估計(jì)非嵌合型腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。這樣，1-D(490)殘存腫瘤細(xì)胞/ D(490)空白對(duì)照組即為精子與腫瘤細(xì)胞的融合率。MTT實(shí)驗(yàn)按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

精子與腫瘤細(xì)胞的融合率以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，以方差分析(ANOVA)的方法進(jìn)行融合率的比較。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)均以SPSS 16.0軟件進(jìn)行，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1　精子與腫瘤細(xì)胞的融合過程

當(dāng)獲能精子加入共培養(yǎng)體系數(shù)分鐘后，精子便可聚集于HeLa細(xì)胞(經(jīng)多個(gè)腫瘤細(xì)胞系檢測(cè)結(jié)果相似，在此僅以HeLa細(xì)胞為例進(jìn)行說明)的側(cè)向周圍，并主動(dòng)地貼附于HeLa細(xì)胞(圖1A)；當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到1 h或以上時(shí)，部分精子能夠穿越HeLa細(xì)胞的細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，精子的尾部尚殘存于腫瘤細(xì)胞外(圖1B)；經(jīng)過約1.5 h我們觀察到呈球形改變的嵌合細(xì)胞(圖1C)；經(jīng)過約2 h的共培養(yǎng)，鏡下可以發(fā)現(xiàn)球形漂浮的腫瘤細(xì)胞，可見殘存的精子尾于細(xì)胞外擺動(dòng)，并推動(dòng)細(xì)胞在培養(yǎng)液上層游動(dòng)(圖1D)。

圖1　精子與腫瘤細(xì)胞融合過程

2.2　融合細(xì)胞的共聚焦顯微鏡成像

經(jīng)過1.5～2 h的共培養(yǎng)后我們采用共聚焦顯微鏡成像的方法確認(rèn)了精子與HeLa細(xì)胞的融合現(xiàn)象，如圖2所示。我們從3個(gè)不同方位(矢狀面、冠狀面和側(cè)面)進(jìn)行了拍攝，均證實(shí)了精子已經(jīng)進(jìn)入HeLa細(xì)胞內(nèi)部。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)個(gè)別腫瘤細(xì)胞能夠與兩個(gè)精子同時(shí)發(fā)生融合(圖2A)，但多數(shù)的腫瘤細(xì)胞通常只與1個(gè)精子融合(圖2B)。此外我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于共培養(yǎng)時(shí)間超過3 h 的殘存貼壁細(xì)胞進(jìn)行三維重建并不能找到融合細(xì)胞。

2.3　共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及對(duì)照研究

鑒于先前實(shí)驗(yàn)觀察到的融合細(xì)胞離壁漂浮生長(zhǎng)的特性，我們對(duì)空白對(duì)照組、嵌套式培養(yǎng)組及直接共培養(yǎng)組實(shí)驗(yàn)后殘存細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3)：空白對(duì)照組和嵌套式培養(yǎng)組殘存細(xì)胞的D(490)顯著高于直接共培養(yǎng)組(p＜0.05)，而前兩者殘存細(xì)胞的D(490)之間并無顯著差異(P=0.71)。

2.4　精子與腫瘤細(xì)胞融合模型的優(yōu)化

新合成的STCM與RPMI 1640培養(yǎng)基比較發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用兩種培養(yǎng)基進(jìn)行腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可以得到類似的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖4A)，但分別應(yīng)用兩種培養(yǎng)基進(jìn)行精子與腫瘤細(xì)胞(HeLa、MCF-7和H441細(xì)胞系)融合實(shí)驗(yàn)時(shí)，與RPMI 1640培養(yǎng)基相比，STCM能夠顯著提高精子與腫瘤細(xì)胞的融合率(p＜0.05，圖4B)，如HeLa細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中與小鼠精子的融合率為13.2%±2.9%，而在STCM中的融合率升高到21.4%±4.1%，后者顯著高于前者，應(yīng)用MCF-7和H441細(xì)胞系可以得到相似的結(jié)論。而且我們發(fā)現(xiàn)STCM能夠在一定程度上加速精子與腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的融合(圖4C)。

3　討論

早在100多年前Austin[9]就發(fā)現(xiàn)精子存在于多種動(dòng)物的子宮黏膜。隨后的多項(xiàng)研究表明：含有Y染色體的微嵌合體可存在于女性的肝臟[10]、 甲狀腺[3，7]、 腦[11]， 輸卵管上皮[12]、 外周血淋巴細(xì)胞[13-15]以及造血和免疫細(xì)胞[16]。

關(guān)于精子與體細(xì)胞融合的體外研究報(bào)道可以追溯到上世紀(jì)70年代。1971年，Sawicki和Koprowski[17]報(bào)道在仙臺(tái)病毒的作用下，兔精子能夠和多種體細(xì)胞相融合。1974年Bendich在《Science》雜志上發(fā)表文章[18]證實(shí)小鼠精子能夠穿透中國(guó)倉鼠成纖維細(xì)胞并形成嵌合細(xì)胞，這種嵌合細(xì)胞攜帶精子的遺傳信息并能夠在體外傳代培養(yǎng)。次年，Higgins等[19]用大鼠的精子獲得了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并在體外連續(xù)培養(yǎng)嵌合細(xì)胞達(dá)50代以上。1999年Takao等[20]發(fā)現(xiàn)位于卵母細(xì)胞外的卵巢顆粒細(xì)胞能夠被精子穿透而形成嵌合細(xì)胞。2009年發(fā)表于《Reproduction》雜志的一篇報(bào)道[21]發(fā)現(xiàn)不同種屬來源的腎細(xì)胞也能夠和精子發(fā)生融合。

圖2　嵌合型腫瘤細(xì)胞的共聚焦顯微鏡成像

相對(duì)于體細(xì)胞，精子可能更容易與腫瘤細(xì)胞發(fā)生融合，因?yàn)橐恍┡R床研究發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于周邊的正常組織，女性肺腺癌[6]和 甲狀腺癌[7]組織中存在更高比例的嵌合細(xì)胞。然而，迄今為止我們尚未看到精子與腫瘤細(xì)胞體外融合的實(shí)驗(yàn)研究。

我們的研究以小鼠精子和多個(gè)不同種屬來源的腫瘤細(xì)胞系建立共培養(yǎng)體系，并對(duì)精子與腫瘤細(xì)胞的融合特征進(jìn)行了初步研究。采用鏡下連續(xù)觀察的方法，我們發(fā)現(xiàn)精子與腫瘤細(xì)胞的融合多發(fā)生于共培養(yǎng)后的1.5～2 h內(nèi)，而且我們發(fā)現(xiàn)與精子融合的腫瘤細(xì)胞貼附能力下降，漂浮于培養(yǎng)基中，并在精子尾部的擺動(dòng)下產(chǎn)生了一定的運(yùn)動(dòng)能力(圖1)。采用共聚焦顯微鏡三維重建的方式我們證實(shí)了精子與腫瘤細(xì)胞融合的可能性(圖2)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，精子與腫瘤細(xì)胞的融合多發(fā)生于共培養(yǎng)的1.5～2 h內(nèi)，對(duì)于共培養(yǎng)3 h后殘存的貼壁細(xì)胞進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察，并沒有發(fā)現(xiàn)融合細(xì)胞。我們推測(cè)可能是共培養(yǎng)3 h后絕大多數(shù)的融合細(xì)胞均漂浮于培養(yǎng)基的上層，因而在貼壁細(xì)胞中難于發(fā)現(xiàn)。

圖4　STCM對(duì)精子與腫瘤細(xì)胞融合模型的優(yōu)化

為排除與精子直接接觸外的其他因素所導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞貼附能力的降低，我們?cè)O(shè)立了空白對(duì)照和嵌套式共培養(yǎng)對(duì)照研究。嵌套式共培養(yǎng)體系可以避免精子與腫瘤細(xì)胞的直接接觸，而使兩種細(xì)胞共存于同一培養(yǎng)體系中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和嵌套式培養(yǎng)組的殘存細(xì)胞總數(shù)顯著多于直接共培養(yǎng)組，而前兩者的殘存細(xì)胞總數(shù)之間并無顯著差異(圖3)，說明非直接與精子接觸不會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞貼附能力的降低，直接共培養(yǎng)組貼壁細(xì)胞數(shù)量的減少應(yīng)為精子與腫瘤細(xì)胞融合形成的嵌合細(xì)胞的貼附能力降低而漂浮生長(zhǎng)所致。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①精子與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)2 h后光鏡下可見懸浮于培養(yǎng)基中的嵌合細(xì)胞；②共聚焦三維成像實(shí)驗(yàn)提示共培養(yǎng)3 h后絕大多數(shù)的融合細(xì)胞已經(jīng)懸浮于培養(yǎng)液中；③嵌套式共培養(yǎng)體系的對(duì)照研究顯示精子與腫瘤細(xì)胞的直接接觸、融合以及嵌合細(xì)胞貼附能力的降低是導(dǎo)致共培養(yǎng)后殘存腫瘤細(xì)胞數(shù)量降低的直接原因，故此我們提出估算精子與腫瘤細(xì)胞融合率的方法，即以共培養(yǎng)3 h后殘存腫瘤細(xì)胞的數(shù)量來衡量精子與腫瘤細(xì)胞的融合率。如果以MTT法估算精子與腫瘤細(xì)胞的融合率(R)，那么，R＝1-D(490)殘存腫瘤細(xì)胞/ D(490)空白對(duì)照組×100%。

為了建立更為穩(wěn)定和高效的精子與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系，我們以新合成的STCM代替常規(guī)使用的RPMI 1640培養(yǎng)基。STCM培養(yǎng)基在參考常用于精子培養(yǎng)的HTF、TYH、BWW及BO培養(yǎng)基主要成分的基礎(chǔ)上，以RPMI 1640和Ham’s F10的混合培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加精子培養(yǎng)的必需成分，使該培養(yǎng)基在滿足細(xì)胞培養(yǎng)的前提下，最大化的提供精子培養(yǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分，從而適合精子與體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STCM培養(yǎng)基在不影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和貼附的情況下(圖4A)，能夠極大地提高精子與腫瘤細(xì)胞的融合率(圖4B)，并且能夠在一定程度上加速精子與腫瘤細(xì)胞的融合(圖4C)。這些結(jié)果提示STCM作為一種新合成的培養(yǎng)基更適合用于精子與腫瘤細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，精子與體細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞融合是一種奇特的生物學(xué)現(xiàn)象。雖然我們很早就認(rèn)識(shí)到了該種現(xiàn)象的存在，但對(duì)于它存在的價(jià)值和意義卻知之甚少。在本研究中我們建立了一種穩(wěn)定的精子與腫瘤細(xì)胞融合的模型，并且以多種方式證實(shí)了精子與腫瘤細(xì)胞體外融合的現(xiàn)象，提出了精子與腫瘤細(xì)胞融合率的估算方法，并采用新型的STCM培養(yǎng)基對(duì)融合模型進(jìn)行了優(yōu)化。雖然如此，仍然有許多的相關(guān)問題亟待解決，比如，哪些相關(guān)因素決定了精子與腫瘤細(xì)胞的融合率？精子與腫瘤細(xì)胞的融合機(jī)制與受精機(jī)制有哪些區(qū)別和聯(lián)系？精子與腫瘤細(xì)胞融合后會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生物學(xué)性狀發(fā)生哪些改變？相信利用我們建立的穩(wěn)定的精子與腫瘤細(xì)胞融合模型上述問題在不久的將來都會(huì)得到合理的解釋與答案。

[1] NELSON J L. Microchimerism：expanding new horizon in human health or incidental remnant of pregnancy?[J]. Lancet，2001，358(9298)：2011-2012.

[2] NELSON J L. Microchimerism in human health and disease[J].Autoimmunity，2003，36(1)：5-9.

[3] SRIVATSA B， SRIVATSA S， JOHNSON K L， et al.Microchimerism of presumed fetal origin in thyroid specimens from women： a case-control study[J]. Lancet， 2001， 358(9298)：2034-2038.

[4] YAN Z，LAMBERT N C，GUTHRIE K A，et al. Male microchimerism in women without sons：quantitative assessment and correlation with pregnancy history[J]. Am J Med，2005，118(8)：899-906.

[5] BRODSKY S V，IVANOV I. Spermatozoa-somatic cell fusion--a mechanism for microchimerism formation[J]. J Theor Biol，2009，259(1)：190-192.

[6] O'DONOGHUE K，SULTAN H A，AL-ALLAF F A，et al.Microchimeric fetal cells cluster at sites of tissue injury in lung decades after pregnancy[J]. Reprod Biomed Online，2008，16(3)：382-390.

[7] CIRELLO V，RECALCATI M P，MUZZA M，et al. Fetal cell microchimerism in papillary thyroid cancer：a possible role in tumor damage and tissue repair[J]. Cancer Res， 2008，68(20)：8482-8488.

[8] World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen[M]. 5th ed. WHO Press，2010.

[9] AUSTIN C R. Entry of spermatozoa into the fallopian-tube mucosa[J]. Nature，1959，183(4665)：908-909.

[10] STEVENS A M，MCDONNELL W M，MULLARKEY M E，et al. Liver biopsies from human females contain male hepatocytes in the absence of transplantation[J]. Lab Invest， 2004，84(12)：1603-1609.

[11] CHAN W F，NELSON J L. Microchimerism in the human brain：more questions than answers[J]. Chimerism，2013，4(1)：32-33.

[12] PACEY A A，HILL C J，SCUDAMORE I W，et al. The interaction in vitro of human spermatozoa with epithelial cells from the human uterine (fallopian) tube[J]. Hum Reprod，1995，10(2)：360-366.

[13] ASHIDA E R，SCOFIELD V L. Lymphocyte major histocompatibility complex-encoded class II structures may act as sperm receptors[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1987，84(10)：3395-3399.

[14] MIKHAIL M A， M'HAMDI H， WELSH J， et al. High frequency of fetal cells within a primitive stem cell population in maternal blood[J]. Hum Reprod，2008，23(4)：928-933.

[15] GILMORE G L，HAQ B，SHADDUCK R K，et al. Fetalmaternal microchimerism in normal parous females and parous female cancer patients[J]. Exp Hematol，2008，36(9)：1073-1077.

[16] KHOSROTEHRANI K，BIANCHI D W. Multi-lineage potential of fetal cells in maternal tissue：a legacy in reverse[J]. J Cell Sci，2005，118(Sup 8)：1559-1563.

[17] SAWICKI W，KOPROWSKI H. Fusion of rabbit spermatozoa with somatic cells cultivated in vitro[J]. Exp Cell Res，1971，66(1)：145-151.

[18] BENDICH A， BORENFREUND E， STERNBERG S S.Penetration of somatic mammalian cells by sperm[J]. Science，1974，183(4127)：857-859.

[19] HIGGINS P J，BORENFREUND E，BENDICH A. Appearance of foetal antigens in somatic cells after interaction with heterologous sperm[J]. Nature，1975，257(5526)：488-489.

[20] TAKAO Y，F(xiàn)UJIWARA H，YAMADA S，et al. CD9 is expressed on the cell surface of human granulosa cells and associated with integrin alpha6beta1[J]. Mol Hum Reprod，1999，5(4)：303-310.

[21] MATTIOLI M，GLORIA A，MAURO A，et al. Fusion as the result of sperm-somatic cell interaction[J]. Reproduction，2009，138(4)：679-687.