吳健彬 江 　妹 王 　玥許 　晶岳文濤3* 王子彤*

（1．首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院/北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所胸外科，北京 　101149；2．首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院/北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細胞生物學研究室，北京 　101149；3．首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中心實驗室，北京 　100026）

世界腫瘤流行病學統(tǒng)計資料[1]和中國癌癥中心公布的數(shù)據(jù)[2]顯示，肺癌高居世界和中國惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率首位。針對肺癌發(fā)病與轉(zhuǎn)移機制，目前雖已研究設(shè)計出大量診斷和治療的相關(guān)策略，且在新藥開發(fā)中取得了顯著的進展，但為避免大多數(shù)新藥由于缺乏臨床療效而遭受巨大經(jīng)濟損失以及影響癌癥患者的生活質(zhì)量[3]，以及在精準醫(yī)療個體化用藥的背景下，建立優(yōu)良的動物模型是研究的關(guān)鍵。目前研究者發(fā)現(xiàn)病人源性移植瘤(patient-derived tumor xenograft，PDTX)模型是唯一擁有直接來自患者的真正腫瘤靶標的模型[3]，該模型能穩(wěn)定地保持原代腫瘤中的病理特征、腫瘤微環(huán)境和異質(zhì)性，準確反映腫瘤的特點和干預(yù)措施的影響[4-5]，因此是一種合理、真實有效和可行的模型，能為臨床個體化治療等提供研究基礎(chǔ)。目前研究顯示，PDTX移植瘤皮下模型的F1代成瘤率在20%～60%[6-9]， F2～F5代的成瘤率在75%[4]以上，由此可見，決定皮下移植瘤模型能否成功的關(guān)鍵在于F1代。NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠均有報道用于PDTX移植瘤模型中，本研究旨在使用NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠分別建立肺癌的PDTX模型，比較NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠肺癌PDTX模型的成瘤率、成瘤潛伏時間和生長曲線以及病理特征的一致性，探討兩種不同小鼠移植瘤模型的特點，為后續(xù)建立更優(yōu)良的動物模型奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實驗動物

NOD/SCID小鼠(36只)和BALB/c裸鼠(10只)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物許可證號SCXK(京)2016-0011]，均為6～8周齡的雌鼠。NOD/SCID小鼠體質(zhì)量20～23 g，BALB/c裸鼠體質(zhì)量15～18 g，所有NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境下，級別為無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級，首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院/北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所屏障環(huán)境實驗動物房[許可證號SYXK(京)2015-0007]。小鼠飼料為清潔級維持鼠料[北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號SCXK(京)2014-0010]，小鼠飲水由實驗動物飲水機提供(北京木牛流馬凈化工程技術(shù)有限公司，MN-LM50J)，小鼠所用墊料及其他與動物接觸的物品均經(jīng)實驗動物專用型滅菌器(Siemens smart line)在121 ℃、30 min條件下高壓滅菌處理。

1.2　非小細胞肺癌組織標本

非小細胞肺癌組織標本來源于首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院胸外科2016年7月—2016年12月經(jīng)肺癌手術(shù)切除的23例患者，納入標準：①術(shù)前未經(jīng)過化療或放療等相關(guān)非小細胞肺癌治療；②術(shù)中冰凍病理結(jié)果提示為非小細胞肺癌且最終病理結(jié)果為非小細胞肺癌；③能提供足夠大小且質(zhì)地較好的新鮮組織標本。排除標準：①5年內(nèi)有其他腫瘤病史；②合并活動性肺結(jié)核等傳染性疾??；③術(shù)前已進行肺癌相關(guān)治療。

1.3　肺癌病人源性皮下移植瘤小鼠模型的建立

選取首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院外科手術(shù)切除的非小細胞肺癌新鮮無菌組織標本，離體時間≤30 min。組織標本保存在含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素及20%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI-1640無菌培養(yǎng)基中，泡沫盒中冰浴，于1 h內(nèi)接種于NOD/SCID小鼠或BALB/c裸鼠皮下。腫瘤組織在動物房屏障區(qū)內(nèi)進行移植，將腫瘤組織轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿上，剔除瘤塊上的非腫瘤組織和壞死部分，用含20% FBS的RPMI-1640無菌培養(yǎng)基清洗3次，把腫瘤組織剪切成2 mm×2 mm×2 mm的小塊，通過套管針經(jīng)皮接種至小鼠雙側(cè)腋下，每例標本接種2只小鼠，共4個部位，接種完成后消毒傷口。將完成接種的小鼠放回小鼠籠具中，在籠外標注小鼠編號、日期等信息。最后將小鼠籠具放回籠架內(nèi)。整個實驗過程均在無菌條件下進行。

1.4　觀察和測算

定時觀察荷瘤小鼠活動情況、精神狀態(tài)、皮毛光澤度和移植瘤組織接種部位皮膚改變等情況。捫查移植瘤生長情況，移植瘤移植后雙側(cè)皮下包塊會先縮小，以包塊消失或縮小至小點后，再次以肉眼可見腫瘤或捫及腫瘤，且當移植瘤體的長短徑＞3 mm時，記錄為腫瘤出現(xiàn)時間。從接種移植瘤組織塊開始到腫瘤出現(xiàn)時間，記為成瘤潛伏時間。每例標本移植于至少2只NOD/SCID小鼠或至少2只BALB/c裸鼠皮下，雙側(cè)腋下均接種移植瘤，移植瘤出現(xiàn)后開始用游標卡尺測量移植瘤體的長徑(rL) 、短徑(rw) ，每周2次，腫瘤體積使用如下公式計算：腫瘤體積V=(×r)/2。移植瘤塊L在4個月內(nèi)形成瘤塊體積＞1 cm3，提示該移植瘤模型成功，根據(jù)測量所得數(shù)據(jù)，計算移植瘤體積并繪制生長曲線圖。若觀察4個月后，小鼠瘤塊仍未生長，或米粒狀消失，則提示該移植瘤建模失敗。分別計算NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠的成瘤率，進行比較分析。

1.5　病理學分析

實驗結(jié)束，處死小鼠，分離移植瘤，肉眼觀察移植瘤形態(tài)、質(zhì)地、活動度，觀察肺、肝、脾和腎臟以及淋巴結(jié)是否存在轉(zhuǎn)移情況，經(jīng)分離得到移植瘤后，將取出的移植瘤組織以10%中性福爾馬林固定液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片后常規(guī)HE染色，進行病理學檢查分析。

1.6　統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以中位數(shù)、均數(shù)或百分率表示，采用Fisher精確概率法比較NOD/SCID小鼠組和BALB/c裸鼠組成瘤率差異是否存在統(tǒng)計學意義，采用t檢驗比較NOD/SCID小鼠組和BALB/c裸鼠組成瘤潛伏時間和成瘤時間的差異是否具有統(tǒng)計學意義，以α=0.05為檢驗水準。

2　結(jié)　果

2.1　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤組織標本相關(guān)臨床病理指標

外科切除的非小細胞肺癌組織標本共23例，且均符合實驗納入標準。23例組織標本中，18例組織標本移植于NOD/SCID小鼠，其中男13例、女5例；鱗癌8例、腺癌9例、腺鱗癌1例；Ⅰ期9例、Ⅱ期1例、Ⅲ期8例，病例中位數(shù)年齡61歲。共5例組織標本移植于BALB/c裸鼠，其中男4例、女1例；鱗癌4例、腺癌1例；Ⅰ期1例、Ⅱ期2例、Ⅲ期2例，病例中位數(shù)年齡55歲。對非小細胞肺癌患者臨床特征(年齡、性別、吸煙、病理類型、TNM分期及其T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況)與NOD/SCID小鼠皮下移植模型是否成瘤進行統(tǒng)計學分析，如表1，結(jié)果顯示：鱗癌、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況這3個因素與移植瘤成瘤建模成功率無明顯相關(guān)。

表1　NSCLC患者臨床特征與NOD/SCID小鼠移植瘤模型成瘤率的關(guān)系

2.2　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠生長情況

23例外科切除的組織標本共移植46只小鼠，其中18例移植于36只NOD/SCID小鼠中；5例移植于10只BALB/c裸鼠中。整個實驗過程中36只NOD/SCID小鼠和10只BALB/c裸鼠進食、飲水正常，無腹瀉、活動遲緩等不良反應(yīng)。無一荷瘤NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠自然死亡。

2.3　NOD/SCID小鼠模型成瘤情況

18例36只NOD/SCID小鼠共計接種72個部位，其中有10例移植瘤塊在4個月內(nèi)體積達1～1.5 cm3，提示移植瘤成功，NOD/SCID小鼠移植瘤成瘤率為55.6%(10/18)。NOD/SCID小鼠在接種平均37 d后可再次捫及長短徑3～5 mm大小移植瘤，成瘤潛伏時間平均為37 d；在接種后平均79 d移植瘤瘤塊體積可達1～1.5 cm3，提示移植瘤建模成功，成瘤時間平均為79 d。生長曲線見圖1。

2.4　NOD/SCID小鼠模型移植瘤大體和形態(tài)學觀察

圖1　NOD/SCID小鼠移植瘤生長曲線

成瘤NOD/SCID小鼠解剖后可見實性結(jié)節(jié)，呈不規(guī)則球體狀或蠶豆狀，表面被覆肉眼可見鮮紅色小血管紋理，切開后可見魚肉樣瘤體，質(zhì)地較硬，個別瘤體切開內(nèi)部為乳白色，質(zhì)地脆。所有NOD/SCID小鼠均未發(fā)現(xiàn)肺、脾和腎等主要臟器有轉(zhuǎn)移情況。成功成瘤的10例NOD/SCID小鼠移植瘤中，有6例為鱗癌，3例為腺癌，1例為腺鱗癌，NOD/SCID小鼠移植瘤病理學診斷與臨床手術(shù)組織標本的病理診斷結(jié)果一致，見圖2。其中，S004(腺癌)模型(圖2)組織學HE染色后，在光鏡下可清晰觀察到支氣管結(jié)構(gòu)，這表明NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型能高度保持病人肺癌腫瘤組織的形態(tài)特征。

圖2　NOD/SCID小鼠模型移植瘤大體和形態(tài)學觀察

2.5　BALB/c裸鼠模型成瘤情況

5例10只BALB/c裸鼠共計接種20個部位，其中有1例移植瘤塊在4個月內(nèi)體積達1～1.5 cm3，提示移植瘤成功，BALB/c裸鼠移植瘤成瘤率為20%(1/5)。BALB/c裸鼠在接種平均60 d后可肉眼觀察到長短徑3～5 mm大小移植瘤，接種后平均110 d移植瘤瘤塊體積可達1～1.5 cm3，提示移植瘤建模成功。生長曲線見圖3。

2.6　BALB/c裸鼠模型移植瘤大體和形態(tài)學觀察

成瘤BALB/c裸鼠解剖后可見實性結(jié)節(jié)，呈橢球體狀，表面被覆肉眼可見鮮紅色小血管紋理，切開后可見魚肉樣瘤體，質(zhì)地較硬。未發(fā)現(xiàn)肺、脾和腎等主要臟器有轉(zhuǎn)移情況。成瘤的BALB/c裸鼠模型病理學診斷為鱗癌，與臨床手術(shù)組織標本的病理診斷結(jié)果一致，表明BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型能保持病人肺癌腫瘤組織的形態(tài)特征。

圖3　BALB/c裸鼠移植瘤生長曲線

圖4　BALB/c裸鼠模型移植瘤大體和形態(tài)學觀察

2.7　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠模型成瘤情況的比較分析

從NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠模型的成瘤率、成瘤潛伏時間和成瘤時間3個因素進行比較分析，如表2所示，NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率(55.6%)，BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型成瘤率為(20%)(P=0.185)；在成瘤潛伏時間上，NOD/SCID小鼠平均為37 d，低于BALB/c裸鼠的平均60 d，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，可得出BALB/c裸鼠的成瘤潛伏時間較長；在成瘤時間上，NOD/SCID小鼠接種后平均79 d成瘤，低于BALB/c裸鼠在接種后平均110 d的成瘤時間，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.004)，可得出BALB/c裸鼠的成瘤時間較長。

表2　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤模型成瘤因素分析

3　討論

2008—2017年10年間NCCN非小細胞肺癌指南[10]更新中可以看出，非小細胞肺癌靶向藥物治療在非小細胞肺癌推薦一線治療中地位日趨穩(wěn)固。PDTX模型是唯一擁有直接來自患者的真正腫瘤靶標的模型[3]，能穩(wěn)定地保留原代腫瘤中的生物學特性[4-5]，2008年Fichtner等[6]將102例肺癌標本移植入NOD/SCID小鼠皮下，并傳代移植至裸鼠，成瘤率為25%(25/102)，早期代數(shù)移植瘤裸鼠與原臨床腫瘤樣本組織學、免疫組化和基因突變狀態(tài)具有高度相似性。2014年Ilie等[11]將100例非小細胞肺癌新鮮組織標本移植入CD1裸鼠或SCID小鼠皮下，成瘤率為35%(35/100)，在組織學和免疫組織化學水平和基因水平均保持了高度一致性，基因水平比較包含高通量測序(next-generation sequencing，NGS)和比較基因組雜交分析(comparative genomic hybridization，CGH)。2017年Wang等[12]將441例肺癌組織標本移植入NOD/SCID小鼠皮下，成瘤率為29% (127/441)，在全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性、甲基化陣列和磷酸酪氨酸-質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學分析中具有高度一致性。以上研究均明確指出成瘤小鼠組織能穩(wěn)定保留相應(yīng)患者的突變靶點，這為新藥的研發(fā)和試驗提供了可能。

本實驗NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率為55.6%，BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型成瘤率為20%，與文獻報道成瘤率在20%～60%之間[6-9]基本一致，John等[7]將157例肺癌組織標本移植入NOD/SCID小鼠皮下，成瘤率為40%(63/157)。羅朋[8]用21例肺鱗癌組織行裸鼠皮下移植，成瘤率為57%(12/21)。本研究從NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠模型的成瘤率、成瘤潛伏時間和成瘤時間3個因素進行比較分析，如表2所示，可得出NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率55.6%，BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型成瘤率為20%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.185)，這可能與納入的樣本量較小有關(guān)。但在成瘤潛伏時間上，NOD/SCID小鼠平均短于BALB/c裸鼠。另外，在成瘤時間上，NOD/SCID小鼠亦短于BALB/c裸鼠。這說明NOD/SCID小鼠比BALB/c裸鼠更適用于非小細胞肺癌皮下移植瘤模型的建立。

成功建模的NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤大體形狀和形態(tài)學觀察如圖2和圖4所示，NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤組織標本與臨床手術(shù)組織標本的病理診斷結(jié)果一致，表明NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型均能保持病人肺癌腫瘤組織的形態(tài)特征，特別是圖2中的S004(腺癌)模型組織學HE染色后，在光鏡下可清晰觀察到支氣管結(jié)構(gòu)，在皮下模型中見到支氣管結(jié)構(gòu)，這更加充分說明了NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型能高度保真病人肺癌腫瘤組織的特性。

在成瘤率、成瘤潛伏時間和成瘤時間3個方面存在較為明顯的差異可能是因為NOD/SCID小鼠屬于T、B、NK細胞聯(lián)合免疫缺陷動物，同時還具有循環(huán)補體缺乏、巨噬細胞和抗原提呈細胞分化及功能不良的特性，而且滲漏現(xiàn)象少，更容易接受異體移植；而BALB/c裸鼠僅為單一T淋巴細胞功能缺陷，B淋巴細胞功能大致正常，NK細胞活性與鼠齡有關(guān)，3～4周齡比同齡普通小鼠活性低，而6～8周齡則比同齡普通小鼠活性高[13]，BALB/c裸鼠體內(nèi)存在的B細胞和NK細胞發(fā)揮了一定的篩選作用，會導致BALB/c裸鼠對腫瘤的非特異性免疫力增強，使得成瘤率較低，成瘤潛伏時間和成瘤時間較長，進而影響非小細胞肺癌腫瘤皮下移植瘤模型的建立。

NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠用于非小細胞肺癌腫瘤皮下移植瘤模型的建立，NOD/SCID小鼠移植瘤模型具有較高的F1代成瘤率(55.6%)，較短的成瘤潛伏時間(37 d)和成瘤時間(79 d)，病理特征均呈基本一致，提示本研究建立的NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型更適合用于病人源性皮下移植瘤模型的建立，這為后續(xù)建立更優(yōu)良的動物模型和采用非小細胞肺癌移植瘤模型進行體外抗腫瘤藥物實驗的篩選等研究奠定了基礎(chǔ)。

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