王霞 薛林貴 張曉華 何小燕 范桃桃 尚海

（1. 蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院 甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2. 蘭州交通大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，蘭州 730070）

植物內(nèi)生菌是指生活史中某一階段或整個(gè)階段定植在植物各組織器官或細(xì)胞間隙內(nèi)的一類(lèi)對(duì)自身植物不引起明顯病害癥狀的一類(lèi)微生物群，其包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌等［1-2］。它們具有豐富的生物多樣性、宿主植物種類(lèi)多樣性及功能多樣性［3］。這些菌株對(duì)植物本身具有促生長(zhǎng)、生物防治、增強(qiáng)抗逆性及生物修復(fù)等多種有益的生物學(xué)功能［4-7］。研究表明，內(nèi)生菌與宿主之間建立了十分密切的生態(tài)關(guān)系，參與植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與轉(zhuǎn)化，并且由于協(xié)同進(jìn)化中基因的橫向轉(zhuǎn)移與交換，內(nèi)生菌還會(huì)獲得與宿主相同的部分代謝途徑，合成與宿主相同或相似的次生代謝產(chǎn)物［8-9］。由于化學(xué)農(nóng)藥使用存在殘留、引發(fā)植物病原菌抗性和再猖獗等隱患，近年來(lái)從藥用植物中分離篩選具有生防作用的內(nèi)生菌以研發(fā)生物農(nóng)藥成為一個(gè)新興的研究熱點(diǎn)［10-11］。因此，從植物中發(fā)掘有益微生物資源具有廣闊前景。

菘藍(lán)（Isatis indigotica），以根入藥又稱板藍(lán)根，十字花科（Cruciferae），菘藍(lán)屬，兩年生草本植物，是應(yīng)用廣泛的大宗藥材，主產(chǎn)于河北、浙江、安徽、河南及河西走廊等地。菘藍(lán)性寒，味苦，主歸心，多被用于治療病毒性感冒、腮腺炎、濕病發(fā)熱、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、流行性乙肝型腦炎及肝炎等［12-13］。

近年來(lái)，有關(guān)于菘藍(lán)的栽培技術(shù)、化學(xué)成分、藥理活性、生物學(xué)特性及中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究較多，但目前有關(guān)菘藍(lán)內(nèi)生菌的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究以從菘藍(lán)的根、莖、葉、葉柄和花中分離出的內(nèi)生細(xì)菌為材料，從微生物的培養(yǎng)、形態(tài)及生理生化指標(biāo)、分子生物學(xué)鑒定和抑菌性入手，探討菘藍(lán)中內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物病原菌的抗菌作用，旨為菘藍(lán)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用和探尋有效拮抗微生物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品菘藍(lán)：采自甘肅省張掖市山丹縣位奇鎮(zhèn)四壩村菘藍(lán)大田種植田，樣品采集后用自封袋密封后馬上回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。

供試菌株：禾谷鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、大斑凸臍蠕孢（Exserohilum turcicum）、鏈格孢霉（Alternaria alternata）均來(lái)自于河西學(xué)院微生物生理生化實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離純化 將采集的鮮菘藍(lán)植株的根、莖、葉、葉柄和花放在自來(lái)水中沖洗干凈，分別將根、莖和葉柄截成 1-1.5 cm 長(zhǎng)，放入無(wú)菌廣口瓶。置于超凈工作臺(tái)紫外滅菌。采用朱士茂報(bào)道的表面消毒方法［14］對(duì)菘藍(lán)的根、莖、葉、葉柄和花進(jìn)行表面滅菌。用無(wú)菌蒸餾水沖洗已表面滅菌后的材料，然后將此液體移入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)觀察是否滅菌徹底。在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌鑷子挑取經(jīng)預(yù)處理和表面滅菌的根莖放在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將其剝皮，用無(wú)菌小刀縱切表皮，中間部分切成0.5 cm×0.5 cm大小，插入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中。再用無(wú)菌鑷子挑取處理過(guò)的葉、葉柄和花各1 g，放于無(wú)菌的盛有石英砂的研缽進(jìn)行研磨，并用無(wú)菌水制成溶液涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上于37℃恒溫培養(yǎng) 24 h（以上每種均接3個(gè)平皿），待菌落長(zhǎng)出后，根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色進(jìn)行初步篩選，反復(fù)劃線分離，純化菌株冷藏保存。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 采用同步培養(yǎng)法將內(nèi)生細(xì)菌用劃線法接種于平板培養(yǎng)基中，然后迅速以無(wú)菌操作將滅菌的牛津杯（直徑為0.5 cm）放置于有禾谷鐮刀菌、大斑凸臍蠕孢和鏈格孢菌的培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，接種在之前內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)基中于28℃恒溫培養(yǎng)，5 d后測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性。以只接病原真菌為對(duì)照，3次重復(fù)，計(jì)算抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-0.5 cm）× 100%。

1.2.3 拮抗菌株的菌落特征及生理生化反應(yīng) 參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》［15］對(duì)篩選的拮抗菌在培養(yǎng)基上采用劃線法劃出單菌落，記錄菌落的形態(tài)、顏色、透明度等，顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特征及革蘭氏染色反應(yīng)。參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［16］對(duì)篩選的內(nèi)生菌菌株進(jìn)行生理生化反應(yīng)的測(cè)定。

1.2.4 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定 將篩選的拮抗內(nèi)生菌株采用高鹽法提取菌體的染色體總DNA。以菌株的總DNA為模板，使用通用引物來(lái)擴(kuò)增降解菌株的16S rRNA基因。5'端引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（Escherichia colibases 8-27），3'端引物為 5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（E. colibases 1507-1492）。50 μL 的 反 應(yīng) 體 系 ：10×Buffer 5.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4.0 μL，引物（1 mmol/L）各 1.0 μL，DNA模 板（50.0 ng/μL）1.0 μL，Taq 酶（5.0 U/μL）0.5 μL，超純水 33.5 μL。PCR 反應(yīng)條件 ：94℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入熱循環(huán)：94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物于0.75%的瓊脂糖凝膠上電泳。根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。回收DNA片段并電泳檢測(cè)其純度。將回收后的DNA片段用pMD18-T通用測(cè)序引物測(cè)序［17］，序列測(cè)定工作委托上海生工生物工程有限公司完成。根據(jù)基因的測(cè)序結(jié)果，將其 序 列 EzTaxon-eserver（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列進(jìn)行同源性比較［18］，采用CLUSTAL_X將菌株的基因序列與其同源關(guān)系相近的序列比對(duì)分析后，把兩頭的序列剪切整齊，用MEGA version 6.0軟件轉(zhuǎn)換格式后，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［19-20］。

2 結(jié)果

2.1 菘藍(lán)內(nèi)生菌的分離純化

通過(guò)微生物學(xué)傳統(tǒng)分離純化的方法從菘藍(lán)的根、莖、葉、葉柄和花中分別分離到7、5、5、2及0株內(nèi)生細(xì)菌，其中以根中的細(xì)菌數(shù)量最多。

2.2 菘藍(lán)內(nèi)拮抗菌株的篩選

以大斑凸臍蠕孢等3種植物病原真菌作為靶標(biāo)菌，對(duì)分離到的19株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行拮抗作用測(cè)定（圖1），如表1，有10株菌對(duì)植物病原菌禾谷鐮刀菌有不同程度的抑制作用，占分離菌總數(shù)的52.6%，抑菌率從19.96%到 94.63%，其中G2對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌率為94.63%；19株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)鏈格孢霉，大斑凸臍蠕孢均有很強(qiáng)的抑制作用，占分離菌總數(shù)的100%，其中菌株G2、J1、Y5及B2對(duì)鏈格孢霉，大斑凸臍蠕孢的抑菌率最大均接近100%，整體來(lái)看，從菘藍(lán)中所分離的19株內(nèi)生細(xì)菌具有較好的抑菌作用。

2.3 篩選菌株的初步鑒定

對(duì)3種病原菌抑制作用較強(qiáng)的菌株G2、J1、Y5和B2 進(jìn)行平板培養(yǎng)，經(jīng)48 h培養(yǎng)觀察，平板菌落特征為：菌落均濕潤(rùn)、不透明、易挑起、生長(zhǎng)速度快，菌落正反面顏色一致，菌落邊緣不整齊或呈缺刻狀。菌株J1、Y5的菌落扁平狀，有光澤，黃色，菌株G2菌落圓形、稍凸起、橙黃色、有粘性，菌株B2菌落淺黃色，邊緣光滑凸起。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征和生理生化特性試驗(yàn)如表2，結(jié)合東秀珠等編的《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)和鑒定手冊(cè)》［16］，菌株G2被初步鑒定為庫(kù)克菌屬（Kocuria）菌株；菌株J1、Y5被初步鑒定為微桿菌屬（Microbacterium）菌株；菌株B2被初步鑒定為短狀桿菌屬（Brachybacterium）菌株。

圖1 菘藍(lán)內(nèi)生菌的拮抗菌篩選結(jié)果

2.4 拮抗菌株總DNA的提取

拮抗菌株G2、J1、Y5和B2的基因組DNA提取結(jié)果見(jiàn)圖2，基因組DNA在電泳圖上的23 130 bp附近一條明顯的條帶，可以用于PCR擴(kuò)增。

2.5 篩選菌株的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

將菌株G2、J1、Y5和B2的基因序列提交到GenBank，將該基因序列在EzTaxon-e server進(jìn)行比較（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）發(fā)現(xiàn)，菌株B2與模式菌株Brachybacterium ginsengisoliDCY80（T）有最大的序列相似性，為98.28%，G2與模式菌株Kocuria roseaDSM 20447（T）有最大的序列相似性，為99.16%；菌株J1和Y5與模式菌株Microbacterium maritypicumDSM 12512（T）有最大的序列相似性，分別為99.36%和99.14%，用MEGA version 5.0軟件包中的Kimura-Parameter Distance 模型計(jì)算進(jìn)化距離，用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖3，1 000次隨機(jī)抽樣，計(jì)算自引導(dǎo)值（Bootstrap）以評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的置信度。結(jié)合菌株細(xì)胞形態(tài)及生理生化指標(biāo)鑒定菌株B2為人參短狀桿菌（Brachybacterium ginsengisoli）；菌株G2為玫瑰色庫(kù)克菌（Kocuria rosea）；菌株J1，Y5為微桿菌屬的黃桿菌（Microbacterium maritypicum）。

表1 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)3種植物病原菌的抑菌效果

表2 菌株G2、J1、Y5和B2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞特征

3 討論

本試驗(yàn)共從采自于張掖的菘藍(lán)中分離得到19株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)過(guò)篩選得到4株拮抗性較高的內(nèi)生細(xì)菌，基于16S rRNA全序列的系統(tǒng)發(fā)育分析及生理生化顯示，供試菌株分屬于3個(gè)菌屬4個(gè)種。其中2個(gè)屬于微桿菌屬，1個(gè)屬于庫(kù)克菌屬，1個(gè)屬于短狀桿菌屬。本研究從菘藍(lán)根、莖、葉、葉柄和花中分離出不同的內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)果僅在菘藍(lán)根、莖、葉、葉柄中分離出數(shù)量有限的內(nèi)生細(xì)菌，這與其他一些關(guān)于內(nèi)生菌分離的結(jié)果并不一致，結(jié)果可能是采集樣本的數(shù)量有限，樣本來(lái)源地較為單一所導(dǎo)致。在試驗(yàn)過(guò)程中，我們以最后一次表面沖洗的無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，并未在其中發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)的任何細(xì)菌，說(shuō)明整個(gè)操作過(guò)程消毒嚴(yán)密，這些內(nèi)生菌并不是從空氣、土壤及其他環(huán)境因素中帶入，或者是試驗(yàn)條件所致的不可培養(yǎng)微生物的丟失。在以后的研究中，我們會(huì)探索其他的培養(yǎng)和檢測(cè)方法，以期更為真實(shí)的揭示內(nèi)生細(xì)菌的遺傳多樣性信息。

圖2 菌株G2、J1、Y5和B2的基因組DNA及16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 篩選菌株的16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

分離結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的菌株既有病原菌，也有非病原菌：黃桿菌革蘭氏陽(yáng)性菌，是從海水和海洋泥漿中分離出來(lái)的，該菌耐極端環(huán)境，參與核黃素代謝，是一種機(jī)會(huì)性致病菌，會(huì)引起食源性疾?。?1-23］，但該菌株抑菌性未見(jiàn)報(bào)道，常見(jiàn)的微桿菌屬的抑菌性報(bào)道有氧化微桿菌等［24-26］。人參短狀桿菌是Hoang 等［27］首次從韓國(guó)人參田土壤中分離到的新型菌株，其能產(chǎn)生鐵載體并對(duì)青霉素G、紅霉素、萬(wàn)古霉素、四環(huán)素、利福平和新霉素具有敏感性，海洋細(xì)菌是潛在有用的抗菌分子的豐富來(lái)源；Liu等［28］從廣東湛江硇洲島褐籃子魚(yú)的胃腸道中分離篩選到19株拮抗菌，其中包括短狀桿菌ZJHD5-23發(fā)現(xiàn)，其對(duì)大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus））、白色念珠菌（Candidia albicans）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）具有不同程度的抑制作用，表現(xiàn)出良好的抗菌譜。短狀桿菌在內(nèi)生拮抗菌中占據(jù)比例很少，一般大多數(shù)關(guān)于短狀桿菌的報(bào)道有環(huán)境污染物的降解［29-30］、耐金屬性［31］、產(chǎn)酶特性［32］等。玫瑰色庫(kù)克菌屬，一般從土壤和水中分離，對(duì)多黏菌、夾竹桃霉素、卡那霉素、萬(wàn)古霉素和鏈霉素等敏感，對(duì)溶菌酶有輕微的抗性［33］，具有耐極端環(huán)境［34］和很好的腐殖質(zhì)還原特性［35-36］。該菌株通常定殖于口咽、皮膚和黏膜的非致病性共生體，一般在免疫功能低下的患者中引起機(jī)會(huì)性感染，目前常見(jiàn)的病例有壞死性縱隔炎、心內(nèi)膜炎和腦膜炎［37-39］。據(jù)報(bào)道［40］該菌株對(duì)植物病原真菌灰霉病（Botrytis cinerea）、西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum f.sp.niveum）、 玉 米 赤 霉（Gibberella zeae）、核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）、柿樹(shù)炭疽菌（Colletotrichum gloesporioides）和細(xì)菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginos）具有很強(qiáng)的抑制作用。

這些菌株中，只有玫瑰庫(kù)色克菌是傳統(tǒng)意義上的病原菌，而其余均為具有特殊生物學(xué)屬性的細(xì)菌，體現(xiàn)在對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力、參與地球化學(xué)物質(zhì)循環(huán)、產(chǎn)生促生作用和良好的抗菌效果等方面。因此，我們猜測(cè)，在菘藍(lán)中分離得到的這些內(nèi)生細(xì)菌，與菘藍(lán)本身具有的良好抗菌效果之間有一定的關(guān)聯(lián)，可能是內(nèi)生菌菌株在長(zhǎng)期進(jìn)化中獲得了植物本身的部分特性，以適應(yīng)特殊的生存環(huán)境，達(dá)到與植物共進(jìn)化的目的。本試驗(yàn)選取的3個(gè)病原菌均為河西走廊制種玉米生育中的常見(jiàn)、多發(fā)性病害。目前對(duì)其防治主要采用化學(xué)方法，而本實(shí)驗(yàn)中所有供試菌株對(duì)其中的兩種主要病原菌均具有良好的抗性作用，尤其是從菘藍(lán)中篩選的內(nèi)生菌菌株G2、J1、Y5和B2對(duì)這些植物病害有有效的拮抗作用。內(nèi)生菌的生防效果及其應(yīng)用有待后續(xù)進(jìn)一步研究，這將為進(jìn)一步利用內(nèi)生菌制備良好的生物制菌肥或菌劑及新藥物的開(kāi)發(fā)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從藥用植物菘藍(lán)中共分離到19株內(nèi)生細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)它們對(duì)河西走廊3種常見(jiàn)植物病原真菌有不同程度的抗菌作用；10株細(xì)菌對(duì)禾谷鐮刀菌有不同程度的抑制作用，占分離菌總數(shù)的52.6%，其中菌株G2對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌率為94.63%；19株細(xì)菌均對(duì)鏈格孢霉、大斑凸臍蠕孢有不同程度的抑制作用，占分離菌總數(shù)的100%。其中菌株G2、J1、Y5和B2對(duì)這兩種病原菌的抑菌率最大，均接近100%。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化檢測(cè)及16S rRNA序列分析，菌株G2為玫瑰色庫(kù)克菌；菌株J1、Y5為黃桿菌；菌株B2為人參短狀桿菌。［1］Suhandono S, Kusumawardhani MK, Aditiawati P. Isolation and

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