李和平 姚運(yùn)法 練冬梅 賴正鋒 洪建基

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，漳州 363005）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus）為錦葵科秋葵屬植物，是一種眾所周知的天然的、健康的蔬菜品種，廣泛分布于非洲、亞洲、美洲等地區(qū)，非洲和亞洲的種植面積超過(guò)了99%［1］。黃秋葵莢果中富含不飽和脂肪酸、膳食纖維、活性多糖、維生素等［2］，經(jīng)常食用幫助消化、增強(qiáng)體力、保護(hù)肝臟、健胃整腸，而且莢果中含有黃酮、類黃酮、葉黃素、生物堿和微量元素，能增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力［3-5］。王君耀等［6］研究小鼠經(jīng)黃秋葵水提取液灌胃15 d，然后進(jìn)行游泳、耐缺氧等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示黃秋葵水可以明顯提高小鼠耐缺氧能力及耐寒耐熱能力，降低小鼠劇烈運(yùn)動(dòng)后血乳酸水平，因而具有抗疲勞作用。由于其果實(shí)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且可以提高運(yùn)動(dòng)耐力，歐美等國(guó)把它列入21世紀(jì)最佳綠色食品名錄之中，并被許多國(guó)家作為運(yùn)動(dòng)員首選蔬菜。黃秋葵被認(rèn)為是次要的作物，直到現(xiàn)在都很少人關(guān)注其遺傳改良工作。

轉(zhuǎn)錄組是某個(gè)物種或者特定細(xì)胞類型產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過(guò)程以及疾病發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)理，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。在錦葵科植物中棉花的轉(zhuǎn)錄組研究最多，有針對(duì)棉花纖維早期發(fā)育的［7］、有針對(duì)根部水脅迫的［8］、有研究苗期棉花雜種優(yōu)勢(shì)的［9］等。而黃秋葵作為一個(gè)小物種，研究報(bào)道比較少，Roland等［10］對(duì)黃秋葵葉片和果實(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了葉片和果實(shí)基因表達(dá)的基本信息；張少平等［11］對(duì)紅秋葵葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，主要研究花青素的合成。而黃秋葵果實(shí)作為主要收獲部位，果實(shí)的發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)成分變化應(yīng)該是研究的主要方向。因此，針對(duì)黃秋葵果實(shí)轉(zhuǎn)錄組信息不全、次生代謝相關(guān)功能基因研究較少的情況，本研究利用RNA-seq技術(shù)研究黃秋葵果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組，可以全面了解黃秋葵果實(shí)基因表達(dá)相關(guān)信息，以及各代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，并且可以以此為基礎(chǔ)開發(fā)SSR、SNP等多種分子標(biāo)記，以期為品種鑒定和遺傳分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃秋葵種質(zhì)GZ167（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所資源編號(hào)）種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所試驗(yàn)基地，7月下旬采集開花后1 d、5 d、12 d的黃秋葵果實(shí)（去除種子，可排除異花授粉造成的影響），每個(gè)處理采3株的果實(shí)，等量混合后提取RNA，即每個(gè)RNA樣品含有3株黃秋葵果實(shí)的RNA，這樣可以排除個(gè)體差異，3份樣品分別標(biāo)記為167-1、167-5、167-12。

1.2 方法

1.2.1 黃秋葵總RNA的提取 黃秋葵總RNA的提取采用成都福際生物有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：RE-05021），RNA濃度和純度通過(guò)Agilent 2100 檢測(cè)。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建 檢測(cè)合格的黃秋葵總RNA用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其成為短片段，再以片段后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（Random hexamers）合成cDNA第1鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I合 成 cDNA第2鏈，經(jīng)過(guò)QiaQuick PCR試劑盒純化并加 EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作，構(gòu)建好的文庫(kù)用Illumina HiSeq2000進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 Unigene的獲得與功能注釋 測(cè)序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng) base calling 轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，稱之為raw reads，再經(jīng)過(guò)平臺(tái)初步的過(guò)濾后稱之為clean reads，然后使用短reads組裝軟件Trinity［10］做轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。Trinity首先將具有一定長(zhǎng)度overlap的reads連成更長(zhǎng)的片段，這些通過(guò)reads overlap關(guān)系得到的不含N的組裝片段作為組裝出來(lái)的Unigene。3個(gè)轉(zhuǎn)錄組一起組裝。

Unigene基本功能注釋信息給出Unigene的蛋白功能注釋、Pathway注釋、COG/KOG功能注釋、Gene Ontology（GO）功能注釋等。首先，通過(guò)blastx將Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)nr（非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)）、SwissProt（蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)）、KEGG（京都基因與基因組百科全書）和COG/KOG（蛋白質(zhì)原核/真核同源數(shù)據(jù)庫(kù)）（evalue＜0.000 01），得到跟給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白（如有并列，取第一條），從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)分析 按照以下配置參數(shù)使用軟件 MISA（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對(duì)轉(zhuǎn)錄組的所有 Unigene 進(jìn)行搜索，尋找 Unigene 中的 SSR，搜索條件為2個(gè)堿基的重復(fù)單元，需要至少6個(gè)重復(fù)才會(huì)被認(rèn)為是SSR，3個(gè)堿基的重復(fù)單元，需要至少5個(gè)重復(fù)才會(huì)被認(rèn)為是SSR，4-6個(gè)堿基重復(fù)至少4次，在此基礎(chǔ)上，如果兩個(gè)SSR序列的距離短于100 bp，就會(huì)被合并當(dāng)作一個(gè)SSR標(biāo)記。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝分析

采用Illumina HiSeqTM2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黃秋葵不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，從表1可以看出，167-1、167-5、167-12三份樣品轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)量和質(zhì)量都較高，為后續(xù)的數(shù)據(jù)拼接組裝提供了較好的數(shù)據(jù)源。

3個(gè)黃秋葵果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲得的reads通過(guò)組裝和拼接共獲得77 476個(gè)Unigene，總長(zhǎng)度達(dá)54 699 979 bp（約 54.7 Mb），平均長(zhǎng)度為 706 bp，N50為1 033 bp，最大拼接長(zhǎng)度為13 091 bp，最小為201 bp，表明組裝效果良好。

表1 數(shù)據(jù)過(guò)濾后統(tǒng)計(jì)表

2.2 黃秋葵果實(shí)Unigene功能注釋

通過(guò)blastx將Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)nr、SwissProt、KEGG 和 COG/KOG，比對(duì)結(jié)果（圖 1-A）顯示，77 476個(gè)Unigene序列在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中有61 559（占79.46%）個(gè)找到相似序列，在SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中有42 609（55.00%）個(gè)找到相似序列，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中有34 972（45.14%）個(gè)找到相似序列，在COG/KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中有25 140（32.45%）個(gè)找到相似序列，4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)一共注釋了61 891（79.88%）個(gè)Unigene序列，未能夠得到注釋的Unigene序列有 15585（20.12%） 個(gè)， 有 18 587（23.99%） 個(gè)Unigene序列序列被4大數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)注釋。如圖1-B所示，前3大物種的同源序列數(shù)量達(dá)到51 502個(gè)，占已注釋基因總數(shù)的83.21%，它們分別是雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii，28139 個(gè)）、亞洲棉（Gossypium arboreum，13 116個(gè) ）、 可 可（Theobroma cacao，10 247）。

以KEGG代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)為依據(jù)，可將13 336個(gè)黃秋葵果實(shí)的Unigene分成128個(gè)代謝途徑（表2），比張少平等［11］報(bào)道的黃秋葵葉片轉(zhuǎn)錄組多了9個(gè)代謝途徑，體現(xiàn)出葉片與果實(shí)轉(zhuǎn)錄組的差異。其中涉及Unigene數(shù)量最多的前5個(gè)代謝途徑分別是核糖體代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)代謝、碳代謝和內(nèi)吞作用。

利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)，將黃秋葵果實(shí)的Unigene進(jìn)行基因生物學(xué)特征功能分類。結(jié)果（圖2）顯示，GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到44 507個(gè)Unigene，可分為細(xì)胞組分、分子功能及生物學(xué)過(guò)程等3個(gè)本體共48個(gè)功能組，其中在參與的生物過(guò)程中，細(xì)胞進(jìn)程（24 970）和代謝進(jìn)程（25 434）含有Unigene最多；在細(xì)胞組分本體中，細(xì)胞進(jìn)程（18 890）及其組織部分（18 884）含Unigene最多；在分子功能本體中，結(jié)合活性（23 656）和催化活性（23 117）含有的Unigene最多。

圖1 四大數(shù)據(jù)庫(kù)注釋維恩圖和前10大物種分布統(tǒng)計(jì)圖

2.3 轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的分布

按照以下配置參數(shù)使用軟件MISA對(duì)轉(zhuǎn)錄組的所有Unigenes進(jìn)行搜索，尋找Unigenes中的SSR，在黃秋葵果實(shí)轉(zhuǎn)錄組77 476條Unigenes序列中發(fā)現(xiàn)3 830個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在3 569條Unigenes中，發(fā)生頻率（含有SSR的Unigenes數(shù)量與總Unigenes數(shù)量之比）為4.61%。其中有3 329條Unigenes序列中只含1個(gè)SSR位點(diǎn)，含2個(gè)及2個(gè)以上SSR位點(diǎn)的Unigenes序列有240條，SSR的分布頻率（SSR的個(gè)數(shù)與總Unigenes的數(shù)量比）為4.94%，黃秋葵轉(zhuǎn)錄組序列中平均14.282 Kb就能發(fā)現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)（表3）。黃秋葵轉(zhuǎn)錄組中SSR的主要重復(fù)類型是三核苷酸重復(fù)，占SSR總數(shù)的59.56%；其次是二核苷酸重復(fù)，占SSR總數(shù)的20.97%；四核苷酸重復(fù)，占SSR總數(shù)的9.69%；五、六核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量較少，總計(jì)9.79%（表3）。SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在4-15次之間，其中5次重復(fù)的最多，有1605個(gè)SSR，占41.91%；其次為6和4次重復(fù)，分別有878、571個(gè)SSR，分別占22.92%和14.91%；15次以上重復(fù)的僅有32個(gè)SSR，占0.84%。從不同串聯(lián)重復(fù)單元類型看（圖3），AAG/CTT重復(fù)類型最多，占19.4%，其次為AG/CT，占9.9%。

圖2 GO功能分類圖

表2 黃秋葵果實(shí)Unigene的KEGG代謝途徑分析

續(xù)表

表3 SSR類型和分類統(tǒng)計(jì)表

3 討論

隨著黃秋葵所含特殊成分及其營(yíng)養(yǎng)保健功效的發(fā)掘，黃秋葵已經(jīng)在非洲、歐美及東南亞等地進(jìn)行了廣泛種植，相關(guān)基礎(chǔ)研究也受到極大的關(guān)注。前人對(duì)黃秋葵的研究主要集中在遺傳育種［12-13］、栽培生理［14-15］、營(yíng)養(yǎng)成分［16］和藥用功效［5，17］等方面，關(guān)于分子生物學(xué)方面特別是功能基因研究方面的研究較少。王旭等［18］采用同源序列克隆和RT-PCR技術(shù)，首次克隆了黃秋葵查爾酮合成酶基因（CHS）cDNA全長(zhǎng)序列。張少平等［11］通過(guò)Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序獲得了紫色黃秋葵葉片基因表達(dá)的基本信息，使研究者對(duì)葉片的代謝途徑有了全面的了解。但是，對(duì)黃秋葵果實(shí)發(fā)育過(guò)程的代謝途徑和轉(zhuǎn)錄組分析的研究至今還未見報(bào)道。本研究中利用RNA-seq技術(shù)分離了大量的多糖代謝、萜類化合物代謝、黃酮和異黃酮類代謝、脂肪酸代謝等次生代謝途徑相關(guān)基因，為今后黃秋葵功能基因的開發(fā)利用等研究奠定了良好基礎(chǔ)。

圖3 SSR不同重復(fù)單元

黃秋葵種質(zhì)資源極其豐富，有些資源可以通過(guò)顏色、葉片形狀、果形等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行辨別，但形態(tài)標(biāo)記數(shù)量有限、觀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)容易受到觀測(cè)者的主觀判斷影響，因此，還必須結(jié)合其他的標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行更深層次的研究。SSR標(biāo)記是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有數(shù)量豐富、覆蓋整個(gè)基因組、多等位基因等特性，目前該技術(shù)已廣泛用于遺傳圖譜的構(gòu)建、目標(biāo)基因的標(biāo)定、指紋圖譜的繪制等研究中。Roland等［10］對(duì)黃秋葵葉片和果實(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到了935個(gè)SSR位點(diǎn)，而本研究中得到了3 830個(gè)SSR位點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其發(fā)現(xiàn)的個(gè)數(shù)，主要原因可能是選擇的材料差異造成的。Roland等的測(cè)序結(jié)果得到最多的3類SSR位點(diǎn)是AT/TA（9.3%）、TTC/GAA（8.3%）和TCT/AGA（6.9%），而本研究中獲得的最多的3類SSR位點(diǎn)是AAG/TCTT（19.43%）、AG/CT（9.95%）和AGC/CTG（8.96%），后期的工作將對(duì)Roland等獲得的SSR位點(diǎn)與本研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，找出相同的SSR位點(diǎn)，豐富、可靠的SSR位點(diǎn)將為黃秋葵品種鑒定和資源分析提供有力依據(jù)。

4 結(jié)論

采用RNA-Seq技術(shù)對(duì)3份黃秋葵果實(shí)進(jìn)行測(cè)序分析，3份測(cè)序材料組裝后共獲得了77 476個(gè)Unigene序列，有61 891個(gè)Unigene在四大數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，占79.88%；以KEGG代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)為依據(jù)，可將13 336個(gè)黃秋葵果實(shí)的Unigene分成128個(gè)代謝途徑，使研究者全面了解了黃秋葵果實(shí)的代謝途徑信息；在黃秋葵果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)3 830個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在3 569條Unigenes中，發(fā)生頻率為4.61%，獲得的最多的3類SSR位點(diǎn)是AAG/TCTT（19.43%）、AG/CT（9.95%）和AGC/CTG（8.96%）。

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